İÇİNDEKİLER
BÖLÜM-1: JEL TEKNOLOJİSİ

Geleneksel Yöntemlerle İlgili Sorunlar
Jel Teknolojisinin Avantajları
Jel Teknolojisinin Kullanım Alanları
Mikrotüplerde Kullanılan Jel Çeşitleri ve İçerikleri
Jel Teknolojisinde Rutin Olarak Kullanılan Solüsyonlar
Test Hücreleri

BÖLÜM-2: İMMUNOHEMATOLOJİ ve ID SİSTEM

 

  1. HEMAGLÜTİNASYON
    Hemaglütinasyon Sonuçlarına Etki Eden Faktörler
    Zeta Potansiyel
    Hemaglütinasyonu Kolaylaştıran Faktörler
  2. KAN GRUP SİSTEMLERİ
    ABO Kan Grup Sistemi
    Rh Sistemi
    Kell Kan Grup Sistemi
    Lewis Sistemi
    Duffy Sistemi
    Lutheran Sistemi
    P Sistemi
    MNS Sistemi
    Kidd Sistemi
  3. TRANSFÜZYON ÖNCESİ İMMÜNOHEMATOLOJİK TESTLER
    1. ABO/Rh TİPLENDİRMESİ
      Yöntem: ID ile ABO/Rh Tiplendirmesi
      Yöntem: ID ile Reverse Gruplama ve Antikor Tarama
      Yöntem: ID ile A Subgruplarının Saptanması
    2. ANTİKOR TARAMA (İNDİREKT COOMBS) VE TANIMLAMA
      Antikor Tarama
      Antikor Tanımlama
      Klinik Önemi Olan Kan Gruplarında Rölatif Antijenite
      Yöntem: ID ile Antikor Tarama (İndirekt Coombs Testi)
      Yöntem: ID ile Antikor Tanımlama
      Yöntem: Otoantikor Pozitif Olgularda Alloantikorları Gösterebilmek İçin Adsorbsiyon
      Yöntem: ID ile Antikor Titrasyonu
      Yöntem: ID ile Eritrositlerin Papain ile Hazırlanması
      ID Kartlarda Kullanılan Coombs (AHG) Serumları
    3. ÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMA (CROSS-MATCH, UYGUNLUK TESTİ)
      Eritrosit Alloantikorlarının Özellikleri ve Uygun Donör Seçimi
      Yöntem: ID ile Cross-match

  4. DİREKT ANTİGLOBULİN (COOMBS) TESTİ (DAT)
    Yöntem: ID ile Direkt Coombs Testi
    Yöntem: ID ile Direkt Coombs Testinde Pozitifliğe Yolaçan İmmünglobulin ve Kompleman Komponentlerinin Gösterilmesi
    Yöntem: ID ile Direkt Coombs Pozitif Olgularda Kan Gruplarının Saptanması- IgG ile Kaplı Eritrositler(1)
    Yöntem: ID ile Direkt Coombs Pozitif Olgularda Kan Gruplarının Saptanması- IgG ile Kaplı Eritrositler(2)
    Yöntem: ID ile Direkt Coombs Pozitif Olgularda Kan Gruplarının Saptanması- IgM ile Kaplı Eritrositler
    Yöntem: Direkt Coombs Pozitif Olgularda Otoantikorların DiaCidel ile Asit Elusyonu
  5. YENİDOĞANIN HEMOLİTİK HASTALIĞI VE JEL TEKNOLOJİSİ
    Yöntem: ID ile Yenidoğanda Eşzamanlı ABO/Rh Kan Grup Tayini ve Direkt Coombs Testi
    ID ile Fetomaternal Hemoraji (FMH) Tarama Testi
  6. DİĞER KAN GRUP SİSTEMLERİNDE JEL TEKNOLOJİSİ
    Yöntem: ID ile P1, Lea, Leb, Lua, Lub, k, Kpa, Kpb, Jka, Jkb, M, N, S, s, Fya, Fyb Antijenlerinin Saptanması
  7. KALİTE KONTROL VE ID
    Yöntem: İç Kalite Kontrol
  8. PAROKSİSMAL NOKTÜRNAL HEMOGLOBİNÜRİ (PNH) VE JEL TEKNOLOJİSİ
    Yöntem: ID ile PNH Tarama Testi
  9. HPA1a TİPLENDİRMESİ TESTİ
BÖLÜM-1: JEL TEKNOLOJİSİ

 

Jel sistem, 1980'lerin başında Fransız Dr. Yves Lapierre tarafından bulunmuştur. Kendisini bu araştırma ya götüren, geleneksel test metodlarının birçok soruna ya da yanlışa neden olması, özellikle zayıf agglutinasyonla sonuçlanan reaksiyonların yorumlanmasının zor olmasıdır. Laboratuar prosedürlerinin standardizasyonundaki eksiklikler de bunda rol oynamıştır. Sephacryl jelin uygulanması ve DiaMed İsviçre' de 3 yıl ArGe kapsamında çalışılması sonucunda rutin kullanımı 1988 de gerçekleşmiştir. Şu anda dünya çapında kullanılmaktadır.

GELENEKSEL YÖNTEMLERLE İLGİLİ SORUNLAR

· İşgücü yoğunluğu
· Mesleki eğitim gerekliliği
· Yıkama işlemine gerek duyulması (örneğin Coombs testleri)
· Test sonuçlarının kalıcı olmaması
· Sonuçların yanlış yorumlanması; daha düşük / negatif sonuç vermeler
· Negatif reaksiyonları teyid etmek için hassaslaştırılmış kontrol hücrelerine gereksinim duyulması
JEL TEKNOLOJİSİNİN AVANTAJLARI

· Laboratuar tekniklerinin standardizasyonu
· Kolay ve çabuk prosedürler
· Kolay ve çabuk yorumlama
· Sabit ve tekrarlanabilir reaksiyonlar
· Sonuçların ertesi gün bile kontrol edilebilirliği
· "Yıkama olmadan" antiglobulin testi
· Eğitim olanağı· Küçük örnek hacimleri
· Laboratuar güvenilirliği
· Uzun raf ömrü, oda-sıcaklığında saklanabilirlik
· Azaltılmış atık
· Otomasyon
JEL TEKNOLOJİSİNİN KULLANIM ALANLARI

ID-sistem son noktası hemaglutinasyon olan herhangi bir immünohematolojik test için kullanılabilir. Aşağıda bugüne dek başarıyla uygulandığı konu başlıkları verilmiştir:

  1. Güvenli Transfüzyon Pratiği ve Jel Teknolojisi

    1. Pretransfüzyon testleri
      • ABO / Rh tiplendirmesi
      • A subgrupları
      • Zayıf "D" antijeni
      • Antikor tarama ve tanımlama
      • Antikor pozitif hastaya uygun kanın seçimi (Rh subgrup ve ABO-dışı gruplar)
      • Çapraz-karşılaştırma (uygunluk testi, cross-match)

    2. Kalite kontrol (internal ve eksternal)
  2. Özel İmmunohematolojik Sorunlar ve Jel Teknolojisi

    • Antikor titrasyonu (IgM ve/veya IgG yapısında)
    • Oto-antikorlar, ilaca-bağlı antikorlar ve bunların elüsyon ile gösterilmesi
    • Taklitçi antikorlar (enzim-pozitif)
    • Soğuk antikorlar
    • Yenidoğanın hemolitik hastalığı
    • Feto-maternal hemoraji taraması
    • Rh subgruplar ve ABO-dışı diğer grup antijenleri (donör seçimi, otoantikor- alloantikor ayırımı, babalık testi gibi Adli Tıp uygulamaları)
    • Çift populasyon varlığı (transfüzyon ve kemik iliği transplantasyonu sonrası)
    • Paroksismal Noktürnal Hemoglobinüri (PNH) taraması
    • Trombosit antikor taramasıC.

  3. Diğer Uygulama Alanları

    • HIV antikor taraması
    • Parvovirüs B19 antijen testi
    • Chagas antikor taraması
    • Ortak hücre anemisi (HbS) taraması

Jel sistemi (ID-Micro Typing System) bir çok yönden tüp yöntemine benzer, bu nedenle uygulamaya yeni başlayan kan bankalarının tümünde sisteme geçiş çok kolay olmuştur. Testte 5x7 cm büyüklüğünde plastik kartlar kullanılır. Her kartın üzerinde 6 mikrotüp vardır. Mikrotüplerin tabanı sonuçların daha iyi değerlendirilmesi için konik, üst kısmı da inkübasyon gerektiren testler için geniş olarak yapılmıştır. Tüp yönteminden farklı olarak jel testte mikrotüpler içerisinde jel vardır. Jelin yapısında, Sephacryl-S 200 denilen bir madde kullanılmıştır. Bu madde başlangıçta toz halindedir, ancak buffer ile karıştırıldığında şişer. Kartlar için jel hazırlanırken jel önce buffer ile yıkanarak şişmesi sağlanır, daha sonra da buffer içerisinde suspansiyonu hazırlanır. Kullanılacağı testin özelliğine göre buffer serum fizyolojik veya LISS solusyonudur. Jel türleri ve içerdikleri maddeler aşağıdaki tabloda gösterilmiştir.

MİKROTÜPLERDE KULLANILAN JEL ÇEŞİTLERİ VE İÇERİKLERİ

JEL TÜRÜ İÇERİK KULLANILDIĞI TESTLER
nötral Jel Reverse gruplama
    Antikor tarama
    Kan grupları
Spesifik Jel + Antiserum Kan grupları
Antiglobulin Jel + AHG Crossmatch
    Antikor tarama
    Antikor tanımlama
    Antikor titrasyon

Santrifuj işlemi çok yavaş veya kısa olursa hatalı pozitif reaksiyonlar, çok hızlı veya uzun olursa hatalı negatif reaksiyonlar görülebilir. Bu nedenle testte zaman ve hız yönünden standardize edilmiş bir santrifuj kullanılır. Santrifuj işlemi 70xg'de 10 dakika yapılır.

 

JEL TEKNOLOJİSİNDE RUTİN OLARAK KULLANILAN SOLÜSYONLAR

ID-Diluent 1: Bromelin solusyonudur. Kan gruplarının saptanmasında eritrosit süspansiyonu hazırlamak için kullanılır. Bromelin ananastan elde edilen proteolitik bir enzimdir. Optimal enzim aktivitesi, yüksek duyarlılık ve özgüllük sağlar. Son kullanım tarihine kadar enzim aktivitesinde bir değişiklik olmaz. Kullanılmadığı zamanlarda buzdolabında muhafaza edilmelidir. Oda ısısında dayanıklılığı 4 haftadır.

ID-Diluent 2: Modifiye LISS (Low lonic Strength Solution) solusyonudur. Serum fizyolojik kullanıldığında ortamdaki sodyum iyonları negatif yüklü eritrosit yüzeyinde, klor iyonları da pozitif yüklü antikor moleküllerinin çevresinde toplanır. LISS solusyonu ortamdaki iyon sayısını azaltır. Böylece pozitif ve negatif yüklerin karşı karşıya gelmesini sağlar. Antijen ve antikor arasındaki ilişkinin artışı eritrosit antijenlerinin antikorlarla birleşme miktarını da artırır.

 

TEST HÜCRELERİ

Eşzamanlı reverse gruplama ve antikor tarama için:
(ID-Diacell A1-A2-B-O-I-II)

Jel test (ID Micro Typing Sistem) için DIACELL ABO ve DIACELL I+II birleştirilerek birlikte sunulmuştur. Bu şekilde tek bir kart üzerinde reverse gruplama ve hızlı antikor tarama testi birlikte yapılabilmektedir.

  1. Isoaglutininler için (DIACELL ABO)
    A1 ccddee
    A2 ccddee
    B ccddee
    O CcDEe
  2. Antikor tarama için (DIACELL I+II)
    Test cell I
    Test cell II

Bu eritrositlerin Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Lutheran ve Xg antijenlerinin durumu aynı ambalaj içerisinde yer alan bir tabloda belirtilmiştir.

Antikor tarama ve tanımlama için:

  1. ID-Diacell I+II+III / ID-Diacell I+II+III P
  2. ID-Diapanel / Diapanel P

Bu grupta yer alan hücreler de Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Lutheran ve Xg antijenleri yönünden test edilmiştir. Ayrıca her bir test hücresinin papain ile muamele edilmiş şekli de hazırlanmıştır. Bu hücreler enzim testlerinde kullanılır. Enzimle muamele sonucu tahrip olan antijenler (Duffy, MNS, Xga) değerlendirme formlarında pembe sütunlar şeklinde belirtilmiştir.

Sonuçların Değerlendirilmesi
Buffer ile yıkama sırasında şişen jel sadece aglutine olmayan eritrositlerin geçişine izin verir. Aglutine olmayan eritrositler santrifuj işlemi sırasında jel tabakasını geçerek konik kısımda çöker. Eritrositler aglutine olmuşsa oluşan aglutinasyonun şiddetine bağlı olarak farklı büyüklükte kümeler oluşur. Kuvvetli aglutinasyonda Kümeler çok büyüktür ve jel üzerinde tabaka oluşturarak kalır, daha zayıf aglutinasyonlarda ise kümelerin bir bölümü jel içerisine difüze olur. Oluşan kümelerin jel diffüzyon güçleri mikroskopik değerlendirmeye ihtiyaç olmaksızın aglutinasyon şiddetini tanımlamaya olanak verir.

BÖLÜM-2: İMMUNOHEMATOLOJİ ve ID SİSTEM
A. HEMAGLÜTİNASYON

Elektrolitli ortamda eritrositlerin yüzeyindeki antijenler, ortamda bulunan kendilerine özgü antikorlar ile birleşecek olurlarsa, eritrositler birbirlerine yapışarak gözle görülebilecek büyüklükte kümeler oluşturarak çökerler. Bu olaya hemaglutinasyon denir. Kan bankalarında yapılan incelemelerin büyük çoğunluğunda eritrositlerin yüzeylerindeki antijenler veya bu antijenlerle ilişkili antikorlar araştırıldığından kullanılan temel serolojik reaksiyon türü hemaglutinasyondur. Kan bankalarında yapılan hataların büyük bir çoğunluğu teknik nedenlere bağlıdır. Test sonuçlarının hatalı pozitif veya negatif olması yaşamı tehdit eden komplikasyonlara neden olacağından, engellemek için hemaglutinasyon reaksiyonlarında sonuca etki eden faktörler iyi bilinmeli ve kullanılan yöntem güvenilir olmalıdır

Hemaglütinasyon sonuçlarına etki eden faktörler
  1. Fiziksel Koşullar
    1. İnkübasyon ısısı:
      İncelenen antikorun tipi ideal inkübasyon ısısının seçiminde farklılık gösterir.
      IgM tipi antikorlar........................4-27°C (Oda ısısı)
      IgG tipi antikorlar........................30-37°C (İnkübatör)
    2. İnkübasyon süresi
    3. Santrifuj:
      Gereğinden yavaş veya hızlı olması ya da gereğinden kısa veya uzun süre yapılması hatalı sonuçlara neden olur.
    4. Ortam:
      pH, LISS solusyonu, enzimler, makromoleküller aglutinasyon oluşum şiddetine etki ederler.
  2. Eritrositler
    Eritrositlerin yüzey antijenlerinin tipi, sayısı, lokalizasyonu ve immünojenitesi, ayrıca homozigot veya heterozigot olmaları sonuçları etkiler (Homozigot : EE, cc vs Heterozigot : Ee, Cc vs.) Homozigot eritrositlerde antijen bağlanma bölgeleri daha fazla ve oluşan agglutinasyon daha kuvvetlidir.
  3. Serum
    Eritrosit yüzey antijenlerinin uyarımı sonucu oluşan antikorlar IgG ve IgM yapısındadır. Ayrıca IgA tipi antikorlarda oluşabilir, ancak bunlar aynı spesifikasyonu gösteren IgG ve IgM tipi antikorlarla birlikte bulunur. Antikorların aglutinasyon gücü antijen bağlama bölgelerinin sayısı ve molekül büyüklükleri ile ilişkilidir. IgM tipi antikorlar serum fizyolojikli ortamda, oda ısısında kolayca aglutinasyon oluştururlar. IgG tipi antikorlar ise bu koşullarda kolayca aglutinasyon oluşturamazlar. Aglutinasyonun gösterebilmesi için genellikle 37°C'da inkübasyona ve ek işlemlere ihtiyaç duyulur.
Zeta Potansiyel

Serum fizyolojik içerisinde süspansiyon yapılan eritrositler birbirlerine ortalama 25 nm uzaklıkta dururlar. Bu uzaklık, eritrositlerin yüzeylerindeki negatif elektriksel yük nedeni ile birbirlerini itmesi sonucu oluşur. Eritrositlerin yüzeylerindeki negatif yükün derecesi zeta potansiyel olarak ifade edilmektedir.
Eritrosit yüzeyi negatif yükle kaplıdır. Serum fizyolojik içerisinde süspansiyon yapıldıklarında katyonlar (+yüklü sodyum iyonu) da eritrosit yüzeyini kaplar. Bu nedenle zeta potansiyel denildiğinde eritrosit yüzeyindeki negatif yük anlaşılmamalıdır. Zeta potansiyel eritrosit yüzeyindeki negatif yük ile onu kuşatan katyonların oluşturduğu potansiyel farkını gösterir. Zeta potansiyelin optimal düzeyi IgM için - 22 - 17 mV, IgG için ise - 11 - 4.5 mV'dur.

Hemaglütinasyonu Kolaylaştıran Faktörler

İki temel yaklaşım şekli kullanılarak hemaglutinasyonun daha kolay oluşması ve gösterilmesi sağlanabilir.

  1. Eritrositler arası uzaklığı kısaltma
    1. Proteolitik enzimler (Papain, bromelin, ficin vs)
    2. Albumin
    3. Polikatyonlar (Polybrene, protamine)
    4. LISS (Low ionic strength solution)
    5. Santrifuj
  2. İki eritrosit arasında köprü oluşturma
    1. Coombs serumu
B. KAN GRUP SİSTEMLERİ

ABO Kan Grup Sistemi

ABO sistemi taşıdığı iki özellik nedeniyle diğer kan grup sistemlerinden farklı ve çok önemlidir:
1- Eritrosit yüzeyinde bulunmayan antijenlere karşı serumda kuvvetli reaktif aglutininleri varlığı,
2- ABH antijenlerinin birçok dokuya ait hücrelerde ve sekresyonlardaki varlığı.
Bu iki karekter ABO sistemini transfüzyon ve doku naklinin en önemli antijeni yapmaktadır. ABO sistemine ait antijenlerin varlığının gösterilmesi oldukça kolaydır. Serumdaki antikorların gösterilmesi prensibine dayanan reverse gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemidir.

ABO Antijenleri

ABO sistemi en az üç gen bölgesi tarafından kontrol edilmektedir. H ve h; A1, A2, B ve O ; Se ve Se. Herbir gen bölgesi birbirinden bağımsızdır. ABO antijenlerinin çok sayıda varyantı tanımlanmıştır, ancak bunlar içerisinde pratik önemi olanlar A1, A2 ve B'dir. Diğer subgruplar oldukça nadir olarak görülür (Tablo). ABH antijen özgüllüğünü oligosakkarid zincirinin terminal ucundaki şeker molekülü sağlar. ABH genleri, immunodominant şekerleri precursor zincire transfer eden spesifik glikoziltransferaz'ın yapımını kodlar. H geni fukosil-transferaz; A gen µ -N -asetil galaktozaminil - transferaz; B geni ise µ - galaktozil - transferaz yapımını kodlamaktadır. O geni sessiz alleldir. H geni bulunmadığında (hh) precursor maddenin dönüşümü olmaz ve Bombay tipi kan oluşur. Bu kişilerde ABO genleri olmasına rağmen A ve B antijeni, H maddesi bu antijenlerin precursoru olduğu için bulunmaz. ABH antijenleri iki farklı şekilde bulunur.

1-Çözünebilir glikoprotein yapısında, sekresyonlar ve plasmada
2-Struktural glikolipid yapısında, eritrosit membranı epitel ve endotel hücrelerinde bulunur.

Çözünebilir ABH antijenleri populasyonundaki bireylerin %80'inde gösterilebilir ve bu bireylere sekretor denir. Bu durum Se ve se genlerinin kontrolündedir. Bu geni se/se şeklinde bulunduran bireylerin (%20) sekresyonlarında ABH antijenleri yoktur ve bu bireylere non-sekretor denir.

Tablo: Sık Rastlanan A, B, O gruplarının tanımlanması

Fenotip Forward Gruplama
(ABO/Rh kart)
Reverse Gruplama
(Dia-cell A1-A2-B-O)
Sekresyon
  Anti-A Anti-B Anti-AB Anti-H Anti-A1 A1 A2 B O  
A1* +4 - +4 -/± +3 - - +4 - H,A
Amt** +4 - +4 +3/+2 +3/+2 - - +4 - H,A
A2*** +4 - +4 +2 - -/+ - +4 - H,A
A3 +2mf - +2 +3 - ? - +4 - H,A
Am -/+ - -/+ +4 - - - +4 - H,A
Ax -/+2 - +/+2 +4 - +2 -/+ +4 - H
                     
B - +4 +4 -   +4 +4 - - H,B
B3 - +1 mf +2 mf +3   +4 +4 - - H,B
                     
O   - - +4 - +4 +4 +4 - H
Oh(Bombay)   - - - +4 +4 +4 +4 - -

* Anti-A1 pozitifliği daima Anti-H pozitifliğinden daha kuvvetlidir.
** Anti-A1 ve Anti-H'da reaksiyon şiddeti aynıdır.
*** Anti-H pozitifliği daima Anti-A1 pozitifliğinden daha kuvvetlidir.

ABH antijenleri 8 haftalık fetusta gösterilebilir, ancak tamamen gösterilmesi 6-18 aylık bebeklerde tamamlanır. Bu nedenle başlangıçta A2 olarak tanımlanan bazı bebekler daha sonra A1 olarak tanımlanırlar. A ve B'nin zayıf antijenik subgrupları oldukça nadir görülür ve klinik önemleri çok fazla olmayabilir. Ancak lösemi gibi hastalıklarda A ve B antijenlerinin zayıflaması gruplamada duyarlı tekniklerin kullanılmasını gerektirir. Adenocarsinoma (mide) vakalarında serumda A veya B çözünebilir maddelerinin konsantrasyonu yüksektir. Bu maddeler tiplendirme serumlarını nötralize ederek zayıf reaksiyonlara neden olabilirler.

Antikorlar:
ABO antikorları doğal ve immun olmak üzere iki grupta incelenirler. Her iki tipte immünizasyon sonucu oluşur.Doğal antikorlarda immünojen muhtemelen bakterial orijinlidir. Doğal anti-A ve anti-B genellikle IgM, immün anti-A ve anti-B ise IgG yapısındadır ve en sık fetal-maternal hemoraji sonucunda oluşur. Anti-A1, A1 hücreleri ile reaksiyona girer. B, O, A2 (%1-8), A2B (%22-35) ve Ax (bir çoğunda) kan gruplarındaki kişilerin serumlarında bulunur. Anti-H, O hücreleri ile çok kuvvetli aglutinasyon oluştururken, A2 ve A3 hücreleri ile daha zayıf aglutinasyon oluşturur. En zayıf aglutinasyon ise A1 ve A1B hücreleri ile oluşur. Anti-H, Bombay tipi (Oh) kan grubu olan kişilerin serumlarında bulunur.

Rh Sistemi

En kompleks eritrosit antijen sistemlerinden birisidir. Üç allel gen çifti tarafından yönetilmektedir. Antijenlerin isimlendirilmesi için üç farklı sistem kullanılmaktadır. Bunlar Fisher-Race, Wiener ve Rosenfield (sayısal) isimlendirmeleridir. Daha kolay kullanılabilir ve anlaşılır olduğu için yaygın olarak Fisher-Race isimlendirilmesi kullanılmaktadır. Bu grup üç allel geni veya izoantijenleri Cc, Dd, Ee olarak isimlendirmiştir. Bu genlerin sekiz değişik birleşmeleri ile sekiz farklı haplotip (gen kompleksi) olur.

Tablo: Sık raslanan Rh fenotip ve genotipleri
Antiserumlarda reaksiyon
D C c E e Fenotip Genotip
+ + + + + DCcEe DCc/DcE
DCe/dcE
dCe/DcE
dce/DCE
+ + + - + DCce DCe/Dce
DCe/dce
+ - + + + DcEe DcE/Dce
DcE/dce
+ + - - + DCe DCe/DCe
DCe/dCe
+ + - + + DCEe DCe/DCE
+ - + + - DcE DcE/DcE
DcE/dcE
+ + + + - DCcE DcE/DCE
+ - + - + Dce Dce/Dce
Dce/dce
- - + - + dce dce/dce
- + + - + dCce dce/dCe
- - + + + dcEe dce/dcE

C,c,E,e ve D antijenlerine karşı gelişmiş antikorlar serumda gösterilmiştir. En sık rastlanan 11 fenotip ve her fenotipte en sık rastlanan genotipler yukarıdaki tabloda gösterilmiştir.

Rh antijenleri:
Macacus Rhesus maymunlarından alınan eritrositlerin tavşanlara verilmesi ile elde edilen antiserumun insanların %85'inin eritrositlerini aglutine ettiğini ilk gösteren Landsteiner ve Wiener'dir ve bu antijene Rh antijeni denilmiştir. Daha sonra bu antijenin A ve B antijenlerinden en yüksek antijeniteye sahip, D antijeni olduğu anlaşılmıştır. Rh sisteminde en güçlü antijen D olduğu için, anti-D ile aglutine olan eritrositlere "Rh+", aglutine olmayanlara ise "Rh-" denir. Rh negatif kişilerin %70'inde bir ünite Rh pozitif kan verilmesinden sonra anti-D antikorları oluşur. D antijeni her zaman güçlü reaksiyon vermeyebilir. Ek işlemler (antiglobulin testi) sonrası gösterilebilen D antijenleri Du olarak isimlendirilir. Kuvvetli reaksiyon verebilen Du antijenleri slide ve hızlı tüp teknikleri ile tanımlanabilir, ancak daha zayıf aglutinasyon oluşturanlar genellikle hatalı olarak Rh negatif olarak tanımlanırlar. Üç tip Du antijeni vardır.

  1. Gen interaksiyonu ile ilişkilidir. C taşıyan gen komplexi ile transpozisyon sonucu oluşur (öneğin Dce/dCe). Her zaman Du antijeni oluşumuna neden olmayabilir.
  2. Eksik D antijenidir. D antijeni en az 4 subnitten oluşur ve yapılan çalışmalar D antijeninin bir mozaik antijen olduğunu göstermiştir. Bunlar RhA, RhB, Rhc ve RhD'dir. Bu subnitlerden bir veya daha fazlası kaybedilirse D antijeni Du gibi hareket eder.
  3. Rh geni daha zayıf reaktif D antijeni yapımını kodlar. Bu nedenle bu tipe genetik Du denilmektedir. Ancak hatalı bir tanımdır, çünkü her üç tipte genetik kontrol altındadır.

Rh sisteminin diğer iki allel genine ait antijenlerin de (C, c, E, e) Du gibi zayıf varyantları tanımlanmıştır. Bunlar Cu, cv, Eu ve ei'dir. Rh antijenlerinde parsiyel delesyona bağlı olarak DC-, DCw, D- - ve D.. ile tam delesyona bağlı Rh-null sendromuda tanımlanmıştır. Rh-null sendromu çok nadir bir durumdur. Tüm Rh antijenleri kaybedilmiştir. Bu kişilerin eritrositleri de defektifdir (stomatosit). Serumlarında Rh antijenlerine karşı antikorlar vardır. M, N, Ena, Fya, Kidd, Dombrock ve i antijenleri artmış, S, s ve U antijenleri azalmış olabilir. Beyaz ırktaki bireylerin %1'inde Cw antijeni pozitiftir. Bu kişilerin çok küçük bir bölümü Cw antijenini C antijeni olmaksızın bulundurur. Benzer şekilde çok az sayıda serumda anti-Cw antikoru anti-C olmaksızın bulunabilir. Ancak C ve Cw arasındaki yakın ilişkinin nedeni açık değildir. Bazı Rh antijenleri ve populasyonda görülme sıklıkları Tablo'da gösterilmiştir.

Tablo: Bazı Rh antijenlerinin populasyonda görülme sıklığı

Fisher-Race Wiener Sayısal Sıklık (%)
D Rho Rh1 85
C Rh' Rh2 70
E Rh'' Rh3 30
c hr' Rh4 80
e hr'' Rh5 97
f(ce) hr Rh6 64
Ce rhi Rh7 69
Cw rhwl Rh8 2

Rh antikorları:
Bazı istisnalar dışında (doğal anti-Cw ve anti-E; IgM doğasınada) immün orijinli IgG yapısında antikorlardır. IgM ve IgA tipi Rh antikorları nadirdir. Intravasküler hemoliz oluşturmazlar. En iyi albumin, enzim ve coombs testleri ile gösterilirler. Transfüzyon öncesi rutin olarak tarandığı için en çok fetal-maternal hemoraji sonucu oluşur. D antijeni dozaj göstermez. Ancak anti-C, anti-c, anti-E ve anti-e sıklıkla dozaj gösterir, yani homozigot hücrelerle heterozigot hücrelere göre daha kuvvetli aglutinasyon oluşturur. Bazı Rh antikorları da sadece antijen komplexleri ile reaksiyona girerler. Bu kompleksler de ce, CE, Ce, cE, ces ve CcEe'dir.

Kell Kan Grup Sistemi

Kompleks bir kan grup sistemidir. Bu sisteme ait antijenlerin biyokimyası yeteri kadar anlaşılamamıştır. Precursor madde, kx, muhtemelen ana eritrosit membran yapısıdır. Kx antijeni nötrofil ve monositlerde de bulunur.
Kell sisteminde de allel genler tanımlanmıştır. Bunlar K-k, Kpa-Kpb, Jsa-Jsb, K11-K17'dir. Çeşitli gen kompleksleri tanımlanmıştır(Tablo)
Kell antijenleri düşük ve yüksek insidanslı olmalarına bağlı olarak iki gruba ayrılır. Kell sisteminin kan bankalarında incelenen allelik antijenlerinin ve bu allerle ilişkili fenotiplerin görülme sıklığı tablo'da gösterilmiştir.

Tablo : Kell sisteminin gen kompleksleri

Gösterilmiş olanlar Teorik olarak mümkün olanlar
K, Kpb, Jsb K, Kpa, Jsb
k, Kpb, Jsb K, Kpb, Jsa
k, Kpa, Jsb k, Kpa, Jsa
k, Kpb, Jsa K, Kpa, Jsa

Tablo: Kell sistemine ait antijen ve fenotiplerin sıklığı

ANTİJEN Sıklığı (%) FENOTİP Sıklığı (%)
K 9.0 K+k- 0.2
k 99.8 K+k-
K-k+
8.8
91.0
Kpa 2.0 Kp (a+b-) < 0.1
Kpb > 99.9 Kp (a+b+)
Kp(a-b+)
2.0
98.0
Jsa < 0.1 Js (a+b-) < 0.1
Jsb > 99.9 Js (a+b+)
Js(a-b+)
< 0.1
> 99.9

Kell antikorları invitro olarak Coombs testi ile gösterilirler. Hemoliz oluşturmazlar ve enzimlerle reaksiyon şiddeti artmaz. Hemolitik transfüzyon reaksiyonları ve yenidoğan hemolitik hastalığı oluştururlar. Kell sistemine ait antijenler, A ve B antijeni hariç tutulduğunda, D antijeninden sonra antijenitesi en kuvvetli yapılardır.

Lewis Sistemi

Lewis antijenleri önce vücut sıvılarında oluşur ve daha sonra eritrosit yüzeyinde absorbe edilir. Lewis ve ABH antijenleri yakın ilişkilidir, çünkü aynı precursoru paylaşırlar. Le geni Fukosiltransferazı kodlar. Lea antijeni eritrosit yüzeyinde sadece Se geni olmadığında gösterilebilir. (Le, H, sese).Le, H, Se genleri olduğunda ise, hem Le hemde Leb maddeleri olmasına rağmen Lea antijeni eritrosit yüzeyinde çok az adsorbe edildiğinden fenotip Le (a-b+) olarak saptanır. Lewis sistemine ait fenotipler ve gen durumu ve görülme sıklığı Tablo'da gösterilmiştir.

Tablo: Lewis Fenotipleri

FENOTİP SIKLIK (%) GEN DURUMU
Le (a+b-) 22 Le, h, sese/le, hh, sese Le, hh, Se
Le(a-b+) 72 Le, H, Se
Le(a-b-) 6* lele, h, Se/lele, H, sese, lele, hh, Se/lele, hh, sese
Le(a+b+) ** 
*Siyah ırkta %22
**Bazan infant ve küçük çocuklarda karşılaşılabilir, sonradan Le (a-b+) olur.

Lek ve Led antijenleri Le(a-b-) fenotipindeki bireylerde bulunur. Lec nonsekretuvar (see), Led ise sekretuvar (SeSe veya Sese)dır. Lex antijeni ise Le(a+b-) ve Le(a-b+) bireylerin tümünde bulunur.
Lewis sisteminin antikorları, anti-Lea ve anti-Leb,doğal antikorlardır ve IgM yapısındadır. Lea ve nadirende Leb invitro hemoliz yapar. Anti-Lec ve Led ise çok nadir rastlanılan antikorlardır ve klinik önlemleri yoktur. Serumdaki Lewis maddeleri invitro olarak tiplendirmede ve invivo olarakta transfüzyon sırasında antikorları nötralize eder. Anti-Lea'ya bağlı hemolitik transfüzyon reaksiyonu gözlenmiştir. Plasentayı geçemedikleri için yenidoğan hemolitik oluşturmazlar.

Duffy Sistemi

Duffy sistemine ait antijenlerin sıklığı beyaz ve siyah ırklarda ise belirgin farklılık gösterir. Beyazlarda iki allellik gen vardır(Fya ve Fyb). Siyahlarda ise bu genlere en azından Fy4 eklenmiştir.Fy(a-b-) fenotipinin olası genotip yapısı beyazlarda FyaFya iken siyahlarda çoğunlukla FyaFy4 şeklindedir. Fy (a-b-) fenotipi ise beyazlarda çok nadirdir. Buna karşın siyahlarda en sık görülen fenotiplerdir ve olası genotipi Fy4Fy4 (veya Fy4Fy) şeklindedir.
Fenotipik olarak Fy (a,b-7 olan bireylerin eritrositleri sıtma etkenlerinden Plasmodium vivax'ın invazyonuna dirençlidir.
Duffy sistemine ait antijen ve fenotiplerin sıklığı Tablo'da gösterilmiştir.

Tablo: Duffy sistemine ait antijen ve fenotiplerin sıklığı

FENOTİP SIKLIĞI (%) ANTİJEN SIKLIĞI (%)
  Beyazlar Siyahlar   Beyazlar Siyahlar
Fy(a+b-) 17 9 Fya 66 10
Fy(a+b+) 49 1     
Fy(a-b+) 34 22 Fyb 83 23
Fy(a-b-) - 68     

Kan bankalarında en çok karşılaşılan Duffy sistemine ait antikorlar Anti-Fya ve Anti-Fyb'dir. İmmün orijinli olan bu antikorlar IgG sınıfındandır. Hem hemolitik transfüzyon reaksiyonlarda hem de yeni doğan hemolitik hastalığında gösterilebilirler.
Enzimler anti-Fya ve anti-Fyb'nin reaktivitesini azaltırken, anti-Fy3, Fy4 ve Fy5'in reaktivitesini artırır.
Anti-Fy3, Fya veya Fyb antijeni taşıyan tüm hücrelerle reaksiyona girerken, Fy(a-b-) hücrelerle reaksiyona girmez. Anti-Fy5'de benzer özellik gösterir, ancak anti-Fy3'den farklı olarak Rh-null hücrelerle, bu hücreler normal Fya ve Fyb'ye sahip olsalar bile reaksiyon vermezler. Anti-Fy5, Fy (a-b-) bireylerde oluşur.
Anti-Fy4, siyah ırktaki Fy (a,b-) hücrelerle aglutinasyon verir. Fya ve Fyb ile de aglutinasyon oluşturabilir. Hem anti-Fy4 hem de anti-Fy3 zayıf reaksiyon oluşturan antikorlardır.

Lutheran Sistemi

Lutheran antijenlerinin tam yapısı yeteri kadar bilinmemektedir. En az 17 Lutheran antijeni vardır. Sık rastlanan fenotipleri Tablo'da gösterilmiştir.

Tablo: Sık raslanan Lutheran fenotipleri

FENOTİP SIKLIK (%)
Lu(a+b-) 0.1
Lu(a+b+) 6.7
Lu(a-b+) 93.2
Lu(a-b-) çok nadir

Lutheran antikorları çok az sayıda olguda transfüzyon reaksiyonu ve yenidoğan hemolitik hastalığına neden olurlar. Anti-Lua uygunsuz transfüzyondan sonra bulunabilir ancak genellikle geçici ve zayıf antikorlardır. Anti-Lub ise çok nadirdir. Her iki antikorda IgG, IgM veya IgA yapısında olabilir. Bir grubu serum fizyolojikli ortamda (genellikle Lua) bir grubu da enzim veya Coombs testleri ile gösterilebilir. Sıklıkla dozaj etkisi gösterirler.

P Sistemi

Biyokimyasal olarak P sistem determinantları ABH ve Li sistemleri ile ilişkilidir ve glikosfingolipit üzerinde sunulur. ABH ve I sistemlerinin tip 2 zincirlerini taşır. P sistem transferazları immünodominat şekerleri glikosfingolipitlere ekler. P sistemine ait fenotipler Tablo'da gösterilmiştir.

Tablo: P sisteminin fenotipleri

FENOTİP SIKLIK (%)
Siyah            Beyaz
SERUMDA BULUNAN
ANTİKOR
P1 79            94 -
P2 21            6 Anti-P1 (sıklıkla)
P1k çok nadir Anti-P
P2k çok nadir Anti-P
p çok nadir Anti-PP1Pk (Tja)

Anti-P1 sıklıkla (tümünde değil) P2 fenotipindeki kişilerde bulunur. Genellikle soğukta reaksiyon veren IgM yapısında antikorlardır. Farklı teknik ve farklı ısılarda reaksiyon verebilir, bazan hemolitiktir. Geniş ısı aralıklarında reaksiyon verebilen bazı anti-P1 antikorları transfüzyon reaksiyonlarına neden olabilir. IgM yapısında olduğundan yenidoğan hemolitik hastalığına neden olamaz. Oto anti-P paroksismal soğuk hemoglobinürili hastlarda bulunur. Genellikle IgG yapısındadır. 4C'da komplemanı bağlar ve 37C'da ise eritrosit lizisine neden olur. Bu olay bifazik hemoliz olarak bilinmektedir. Anti-PP1Pk(Tja) daima hemolitiktir ve hem transfüzyon sonrası hemde yenidoğan hemolitik hastalığında gösterilmiştir.

MNS Sistemi

MN antijenleri eritrosit membranında glycophorin A üzerinde bulunmuşlardır. Glycophorin A 131 aminoasit ve 16 oligosakkaridden oluşur. M determinantı polipeptiddir ve ser-ser-thr-thr-gly, N determinantı ise leu-ser-thr-thr-glu ile sonlanır. Ss ve U antijenleri ise glycophorin B üzerinde sunulur. Glycophorin B daha kısa bir sialoglikoproteindir. S ve S genleri ile M ve N genleri arasında sıkı ilişki vardır. U-eritrositlerin tümü S-s-'dir. (Rh-null eritrositler hariç). Ancak S-s-eritrositlerin yaklaşık %16'sında U antijeni pozitiftir. Sisteme ait diğer antijenler olan M1, Hu ve He daha çok siyah ırkta gösterilmiştir. MNSs sistemine ait fenotipler Tablo'da gösterilmiştir.

Tablo: MNSs sisteminin fenotipleri

ANTİSERUMLARLA REAKSİYON FENOTİP OLASI GENOTİP
M N S s U    
+ -       M MM
+ +      MN MN
    + - + SU SSU, SSuU
    + + + SsU SsU
    - + + sU ssU, sSuU
    - - - S-s-U- SuSuU-
    - - - S-s-U- SuSuU+

Anti-M ve Anti-N doğal olarak görülür ve IgM yapısındadır. Anti-S ve anti-s sıklıkla, anti-U ise daima IgG yapısındadır. Anti-M ve anti-N asit pH'da daha iyi reaksiyon verir. Anti-M, anti-N ve anti-S'in enzimle muamele edilmiş eritrositlerle aglutinasyon güçleri azalır.
Anti-s ve ve anti-U IgG yapısında olduğu için optimal reaksiyon ısıları 37C'dır.Anti-M ve anti-N ise 37C'ın altında aglutinasyon oluşturur. IgG yapısında nadiren görülür ve nadiren yenidoğan hemolitik hastalığına neden olur. Bu vakalarda hastalık çok ağırdır. Anti-S, anti-s ve anti-U'ya bağlı transfüzyon reaksiyonları ve yenidoğan hemolitik hastalığı bildirilmiştir.

Kidd Sistemi

Diğer kan gruplarında olduğu gibi çok sayıda antijeni olmayan bir sistemdir. Jka ve Jkb olmak üzere iki allelik gen vardır. Üçüncü gen ise Jk genidir.
Kidd sisteminin antijenleri Jka, Jkb ve JkaJkb'dir. Lökosit ve trombositlerde bulunmazlar. Jk(a-b-) fenotipi çok nadir olarak görülür ve her iki ebeveynden alınan Jk geni ile ilişkilidir. (silent allel)
Anti-Jka ve anti-Jkb, IgG yapısında ve Coombs testi ile gösterilebilen antikorlardır. Sıklıkla dozaj gösterirler ve gösterilebilmeleri için enzim ile muamele edilmeleri gerekebilir.
Kidd antikorlarına bağlı transfüzyon reaksiyonları ve yeni doğan hemolitik hastalığı çok sık olarak görülmez.

C. TRANSFÜZYON ÖNCESİ İMMÜNOHEMATOLOJİK TESTLER

1. ABO/Rh TİPLENDİRMESİ

ABO ve Rh tiplendirmesi hastanın tam profilini veren bir kartta uygulanır. Sonucun geçerli olabilmesi için kontrol (ctl) mikrotüpü her zaman negatif olmalıdır. Anti-D ile pozitif reaksiyonlar Rh POZİTİFİ (D +)gösterir; Anti-D negatifken anti-CDE ile pozitiflik Rh-pozitif anlamına gelmez; bu reaksiyon C ve/veya E pozitifliğinden gelmektedir.

Yöntem: ID ile ABO/RH GRUPLARININ SAPTANMASI

ID Kartlar;
ABO/Rh A-B-AB-C-CDE-Ctl
ABO Confirmation A-B-D/A-B-D (Bir kartta iki örnek)
Anti-D D-D-D-D-D-D (Bir kartta altı örnek)
Rh subgroups+Kell(K) C-c-E-e-K-Ctl
C-Cw-c-E-e-K
Anti-Cw Cw-Cw-Cw-Cw-Cw-Cw(altı örnek)
TESTİN YAPILIŞI
ERİTROSİT SÜSPANSİYONU
ID-Diluent 1. . . . . . . . .0,5ml
Konsantre eritrosit . . . . .25µl
(tam kan . . . . . . . . . . 50µl)
İyice karıştırılır ve 10 dakika oda ısısında inkübe edilir.
TEST:
  • Kullanılacak karta hastanın adı, protokol numarası yazılır
  • Eritrosit süspansoyinu yeniden iyice karıştırılır
  • Tüm mikrotüplere 10 µl eritrosit süspansiyonu dağıtılır.
  • Kart santrifüj edilir ve değerlendirilir.
DEĞERLENDİRME
  • Oluşan agüitasyonun şiddeti ++++,+++,++,+,-, olarak kart üzerinde ilgili bölüme kayıt edilir.
  • A ve AB mikrotüplerinde aglütinasyon +++,++,+ ise zayıf antijenik A gruplarının varlığı düşünülmelidir. Reverse gruplama Anti-A+ ve Anti-H kartları ile A alt grubunun türü tanımlanabilir (Bakınız Tablo)
  • "D" mikrotüpünde aglutinasyon ++++ ise "Rh pozitif", +++,++,+ ise "zayıf D" olarak tanımlanmalıdır.
  • Rh sisteminin değerlendirilmesinde:
    D(+) ve CDE (+) ise . . . . . .Rh pozitif
    D(-) ve CDE (-) ise . . . . . . .Rh Negatif
    D(-) ve CDE (+) ise . . . . . . Rh negatif, C ve/veya E pozitif
  • Ctl (kontrol) miktotüpü daima negatif olmalıdır. Şayet pozitif ise otoantikor varlığı düşünülmelidir. Kontrol tüpü pozitif olgularda değerlendirme hatalı olur. Eritrositler 3-4 kez 37°C'a kadar ısıtılmış serum antikorlar ile kaplanmışsa bu teknik ile problem çözümlenemez. Thiol (DTT) veya 2ME kullanılır.
Yöntem: ID ile Reverse Gruplama ve Antikor Tarama
ID Kart;
Reverse grouping with antibody screening
İlk üç mikrotüpdeki jel serum fizloyojik, son üç mikrotüp ise Coombs serumu içerir.
Test hücreleri:
ID-DiaCell A1-A2-B-0-I-II (6x10ml)
Test hücreleri 8 hafta miadlı olarak üretilmektedir. Test hücreleri kan merkezine ulaştığında ortalama miadı 4-6 haftadır.
Eğer kendi hazırladığınız test hücrelerini kullanacak iseniz eritrositler iki kez serum fizyolojik ile yıkanır.

ID-Diluent 2 . . . . . . . . . . . . 5ml
Konsantre eritrosit (sediment) . . . 10 ìl
4-8 C'da 1 hafta stabildir.
TESTİN YAPILIŞI
  • Kart üzerinde mikrotüplerin hemen altındaki bölüme dağıtılacak test hücrelerinin adları yazılır (A1, A2, B, O, I,II)
  • Test hücrelerinin oda ısısına gelmesi beklenir. Yukarı-aşağı yavaşça çevrilerek iyice karışması sağlanır.
  • Tanımlanmış herbir mikrotüpe ilgili hücre 50 µl dağıtılır.
  • Tüm mikrotüplere 50 µl serum veya plazma eklenir.
  • Oda ısısında 10-15 dakika inkübe edilir.
  • Santrifüj edildikten sonra değerlendirilir
DEĞERLENDİRME
  • Aglutinasyon ++++,+++,++,+,- olarak kart üzerine kayıt edilir.
  • Yorum:
    A1 A2 B O İsoaglutinin Kan grubu
    - - + - Anti-B A
    + + - - Anti-A B
    - - - - Yok AB
    + + + - Anti-A, AntiB O
  • I ve II test hücrelerinin değerlendirilmesi: Eğer hücrelerden herhangi birisi ile aglutinasyon oluşmuş ise incelenen serumda test hücrelerinin yüzeylerinde taşıdıkları kan grup antijenlerinden herhangi birisine karşı antikor mevcuttur. Antikor tanımlama testi yapılmalıdır. (Bakınız antikor tarama ve tanımlama testleri).
Yöntem: ID ile A SUBGRUPLARININ SAPTANMASI
ID Kartları;
Anti-A1 (Lectin). . . . . . . .Her kartta 6 test yapılır
Anti-H (Monoclonal). . . . . . .Her kartta 6 test yapılır

ID-Diluent 1: Bromelin solusyonudur. Kullanılmadan önce oda ısısına gelmesi beklenmelidir.
* Anti-A1(Lectin) ve Anti-H(Monoclonal) aynı test prosedürüne sahiptir.
TESTİN YAPOILIŞI
ERİTROSİT SÜSPANSİYONU
ID-Diluent 1 . . . . . . .0.5ml
Konsantre eritrosit. . . .25 µl
(Tam kan . . . . . . . . .50 µl)
İyice karıştırılır ve 10 dakika oda ısısında inkübe edilir.
TEST
  • Kullanılacak karta hastanın adı, protokol numarası yazılır
  • Eritrosit süspansiyonu yeniden iyice karıştırılır.
  • Tüm mikrotüplere 10 µl eritrosit süspansiyonu dağıtılır.
  • Kart santrifüj edilir ve değerlendirilir.
DEĞERLENDİRME

Aglutinasyon ++++, +++, ++, +, -, olarak kart üzerinde tanımlanır. Test sonuçlarını yorumlamak için Tablo'ya bakınız.

Kan Grubu Forward Gruplama Reverse Gruplama Tükürük
  Anti-A Anti-B Anti-AB Lectin-H Lectin-AI A1-cell A2-cell B-cell O-cell  
A1 ++++ - ++++ - ++++ - - ++++ - A ve H
Aint ++++ - ++++ +++ ++ - - ++++ - A ve H
A2 ++++ - ++++ ++ - ?(+/-) - ++++ - A ve H
A3 ++mf - ++ +++ - ? - ++++ - A ve H
Am -/± - -/± ++++ - - - ++++ - A ve H
Ax -/± - +/++ ++++ - ++ -/+ ++++ - H
Ael - - - ++++ - ++ - ++++ - H
B - ++++ ++++ -   ++++ ++++ - - B ve H
B3 - +mf ++mf ++++   ++++ ++++ - - B ve H
Bm - - -/± ++++   ++++ ++++ - - B ve H
Bx - -/± +/++ ++++   ++++ ++++ - - H
AB ++++ ++++ ++++ - ++++ - - - - A, B, H
A2B ++++ ++++ ++++ - - ? - - - A, B, H
0 - - - ++++ - ++++ ++++ ++++ - H
Oh (Bombay) - - - - ++++ ++++ ++++ ++++ ++++  
A (rulo+) ++++ ++ ++++ ++ ++++ ++ ++ ++++ ++ A ve H

2. ANTİKOR TARAMA (İNDİREKT COOMBS) VE TANIMLAMA

Kan grup antijenlerine karşı gelişmiş antikorlar transfüzyon öncesi yapılan cross-match, reverse gruplama ve antikor tarama testleri ile gösterilebilirler. Bireyin eritrositlerinin yüzeyinde taşımadığı antijenlere karşı geliştirdiği antikorlara alloantikor, kendi eritrositlerinin yüzeyindeki antijenlere karşı geliştirdiği antikorlara da otoantikor denir. Beklenmedik alloantikorlar denildiğinde doğal olarak bulunan anti-A ve anti-B dışındaki antikorlar kastedilir. Populasyonda %0.3-2 oranında bulunar. Bu olguların bir grubunda transfüzyon veya gebelik gibi nedenlerle yabancı eritrositlerle karşılaşma antikor oluşumuna neden olmuştur, diğer bir grubunda ise neden bilinmemektedir.
Antikorlar serumda serbest ve/veya eritrositlerin yüzeyini kaplamış olarak bulunabilirler. Eritrositlerin yüzeyini kaplamış antikorlar direkt Coombs testi ile, serbest dolaşan antikorlar ise indirekt Coombs testi ile gösterilirler.

Antikor tarama

İndirek coombs testi (antikor tarama testi) transfüzyon öncesi alıcılarda ve gebelerde yapılmalıdır.
Transfüzyon öncesi antikorun tanımlanması bu antijeni taşımayan donörlerin seçilmesine olanak sağlar ve transfüzyon reaksiyonlarını belirgin şekilde engeller. Bazı kan bankalarında donörde de antikor tarama testi yapılmaktadır. Mutlaka gerekli bir işlem değildir. Ancak bazı acil durumlarda Rh negatif bir kan Rh pozitif kişiye verilebilir. Eğer donörde anti-D pozitif ise alıcıda Coombs testinin pozitif olmasına neden olur. Diğer taraftan kişinin immünizasyon durumunu bilmesi de yararlıdır.
Gebelerin serumlarında bulunan IgG yapısındaki antikorlar plasentadan geçerek fetusun eritrositlerini sensitize ederler. Eritrosit tahribi antikor titresine bağlıdır Eğer duyarlı bir tarama testi kullanılmak isteniyorsa en az iki donör hücresi kullanılmalıdır. İndirekt Coombs testi pozitif bulunan tüm olgularda antikor tanımlanmalıdır. Bu yolla sadece yenidoğan hemolitik hastalığının takibi değil aynı zamanda Rh immunglobulin endikasyonu da değerlendirilebilir.
Antikor tarama testlerinde otokontrol yapılması önemlidir. Bu yolla mevcut antikorun alloantikor yada otoantikor olup olmadığını söyleyebilmek mümkün olur. Ancak yakın zamanda transfüzyon yapılan olgularda alloantikorların otoantikor gibi gözükebileceği akılda tutulmalıdır (Alıcıdaki alloantikorlar donörün eritrositlerini kaplayarak otokontrolün pozitif olmasına neden olur).

Otokontrol Test Hücresi Antikor
Pozitif Negatif Otoantikor
Negatif Pozitif Alloantikor
Pozitif Pozitif Otoantikor
Otoantikor + Alloantikor

Duyarlı bir antikor tarama testinde iki veya üç farklı donörden alınmış test hücreleri kullanılmalıdır. Mümkün olabildiğince homozigot hücrelerin (EE, ee, cc, CC vs) kullanılması duyarlılığı artırır. Anti-c, Anti-Jka ve Anti-M antikorları homozigot hücrelerle heterozigot hücrelere göre daha iyi reaksiyon verir. Hatta bazı kişilerde sadece homozigot hücreler kullanılarak gösterilebilir. Bir antikor eğer homozigot hücrelerle heterozigot hücrelere göre daha kuvvetli aglutinasyon oluşturuyorsa dozaj gösterdiğinden söz edilir.
Antikor tarama testlerinde 37C'da inkübasyon yapılır; 37C'da in vitro aglutinasyon oluşturan antikorlar in vivo olarak da eritrositleri tahrip (hemoliz) yeteneği taşırlar. Ancak soğuk aglutininlerin gösterilebilmesi için inkübasyon +4C'da yapılmalıdır.
Testin yapıldığı ortam da önemlidir. IgM yapısındaki antikorlar serum fizyolojikli ortamda aglutine olurken IgG yapısındaki antikorlar daha çok LISS veya albumin kullanımı ile gösterilebilirler. Jel testinde antikor tarama ve tanımlama çalışmalarında bu nedenle iki farklı kart kullanılmaktadır. İndirekt Coombs testinde LISS/Coombs, Enzim testi ve soğuk algulitininlerin araştırıldığı durumlarda da NaCl/Enzyme/Cold agglutinin kartları kullanılır.

Antikor Tanımlama

Antikor tarama testi pozitif olgularda pozitifliğe neden olan antikorun hangi eritrosit antijenine veya antijenlerine karşı geliştiği daha çok sayıda test hücresi kullanılarak tanımlanabilir.
Negatif bir antikor tarama testi serumda antikor bulunma olasılığını ekarte ettirmez. Serumda, az rastlanılan eritrosit antijenlerine karşı antikor varsa tarama testleri negatif olabilir. Bu antikorların varlığı uygun olmayan bir cross-match ile ortaya çıkabilir.
Antikor tarama testine başlamadan önce:

  1. Hastanın klinik tanısı, daha önce transfüzyon yapılıp yapılmadığı, kadın ise doğum veya düşük yapıp yapmadığı öğrenilmelidir.
  2. Kan grubu, Rh fenotipi, cross-match ve antikor tarama testine ait bulguları yeniden gözden geçerilmelidir.

Antikor tanımlama çalışmalarında mutlaka otokontrol kullanılmalıdır. Tarama testlerinde olduğu gibi otokontrol kullanımı serumdaki antikorun alloantikor ve/veya otoantikor olup olmadığını saptamaya yardım eder.
Antikor tanımlama çalışmaları için hazırlanmış birçok ticari test paneli 8-10 test hücresi içermektedir. ID-Diapanelde 11 test hücresi vardır. Bu hücreler pratikte olası antikorların tanımlanmasını mümkün kılar.
İndirekt Coombs testi, enzim test ve soğuk aglutininleri araştırmaya yönelik testler birlikte çalışılmalıdır. Her bir test hücresinin farklı ortamlardaki aglutinasyon şiddeti ayrı ayrı kaydedilmelidir. Bu değerlendirmeleri jel testinde yapabilmek oldukça kolaydır.
Dozaj faktörü antikor tarama testlerinde olduğu gibi antikor tanımlama testlerinde de akılda bulundurulmalıdır. Diğer taraftan enzimle muamele sonrası Duffy, MNS ve Xga sistemine ait antijenler tahrip olurken Rh ve Kidd sistemine ait antikorlara bağlı aglutinasyonun şiddeti artar. I, Lea, Leb, Sd, Lua, Lub, vel, Hy, Csa, Ch ve Rg antijenleri kord eritrositleri ile, adult eritrositlerine göre daha zayıf reaksiyon verir. Aglutinasyon antijen panelinde belirtilmemiş bir antijene karşı gelişmiş antikorlara da bağlı olabilir.
Serumda iki veya daha fazla sayıda antikor da bulunabilir. Bu durumda sonuçların yorumlanması güçleşir. Birden fazla antikor varlığı:
  1. Aglutinasyon paterni bir tek antikor varlığı ile açıklanamıyorsa,
  2. Farklı testlerde elde edilen sonuçlar birbirlerini desteklemiyorsa,
  3. Aglutinasyon şiddetlerindeki fark dozajla açıklanamıyorsa birden çok antikor varlığı düşünülmelidir.

Çok sayıda kan transfüze edilmiş kişilerde birden çok antikorun varlığı veya otoantikorların alloantikorlara bağlı reaksiyonları örttüğü düşünüldüğünde ileri çalışmalar ve özel teknikler kullanılmalıdır (hemaglutinasyon inhibisyon, elusyon, pH modifikasyon, absorbsiyon vs.)
Antikor tanımlama çalışmaları oldukça karmaşık işlemlerdir. Ancak Jel Santrifügasyonda oldukça kolaydır. Tecrübe ve özel ilgi birikimi gerektirir. Bu nedenle sadece sınırlı sayıda merkezde çalışma yapılmalı ve testi yapan diğer kan bankaları sonuçlarını bu referans merkezlerinde mutlaka doğrulatmalıdır.

Klinik Önemi Olan Kan Gruplarında Rölatif Antijenite

· Spesifik antijen negatif bir kişiye pozitif 1 ünite kan verilmesi durumda antikor oluşturma olasılığı

KAN GRUP ANTİJENİ ANTİKOR OLUŞMA OLASILIĞI
D 70.0
C 0.22
c 4.1
E 3.38
e 1.12
   
K 10.0
k 3.0
   
Jka 0.14
Jkb 0.06
Fya 0.46
S 0.08
s 0.06

Yöntem: ID ile Antikor Tarama (İndirekt Coombs Testi)

ID Kartları;

  1. LISS/Coombs................İndirekt Coombs için
    NaCl/Enz/Cold aglutinin......Enzim test ve soğuk agglutinin
  2. Coombs/Enzyme Combined İndirekt Coombs ve enzim aynı kartta
  3. Reverse grouping/ab secreening 4,5 ve 6.mikrotüpler Antikor tarama içindir.

ID Test Hücreleri

  1. İndirekt Coombs ve Soğuk aglutininler için
    ID-Diacell I+II+III
    ID-Diacell I+II
  2. Enzim testi için (Papainle muamele edilmiş)
    ID-Diacell I+II+III P
    ID-Diacell I+II P

ID-Diluent 1: Enzim testinde otokontrol mikrotüpüne eklemek için kullanılır. Bromelin solusyonudur.
ID-Diluent 2: Otokontrol için eritrosit süspansiyonu hazırlamak amacı ile kullanılır. LISS solusyonudur.

Örnekler:

  1. Test için hasta serum veya plasması
  2. Otokontrol için tam kan

TESTİN YAPOILIŞI

* İndirekt Cooombs test ve enzim test için tüm materyal oda ısısına gelene kadar beklenmelidir. ** Soğuk aglutininler için tüm materyal, kan örnekleri ve ID-Kartlar buzdolabına kaldırılmalıdır.

ERİTROSİT SÜSPANSİYONU
ID-Diluent 2 . . . . . . .1 ml
Kan................. . . .10 ìl
İyice karışması sağlanır.

TEST

  1. Her test edilecek sistem (indirekt Coombs, Enzim, So?uk aglutinin) için uygun kartlar seçilir.
  2. Kartların üzerine hasta adı kaydedilir.
  3. Mikrotüpler kullanılacak hücrelere göre tanımlanır. Bu işlem çalışırken veya değerlendirirken olası karışıklıklara engel olur.
  4. Diacell I+II+III ile çalışırken otokontrol kullanılmadan aynı kartta iki hasta çalışabilir.

İndirekt Coombs testi:

Kullanılan Kart ve Test Hücresi, LISS/Coombs kart-ID-Diacell I+II+III

MİKROTÜPLER
  1 2 3 OTOKONTROL
Test cell I (DIACELL-I) 50 µl - - -
Test cell II (DIACELL-II) - 50 µl - -
Test cell III (DIACELL-III) - - 50 µl -
Eritrosit Süspansiyonu - - - 50 µl
Serum veya plazma 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl
*15 dakika 37ºC'da inkübe edilir.

Enzim Testi:

Kullanılan Kart ve Test Hücresi, NaCl/Enzyme/Cold agglutinin kart-ID Diacell I+II+III P

MİKROTÜPLER
  1 2 3 OTOKONTROL
Test cell IP (DIACELL-IP) 50 µl - - -
Test cell IIP (DIACELL-IIP) - 50 µl - -
Test cell IIIP (DIACELL-IIIP) - - 50 µl -
Eritrosit Süspansiyonu - - - 50 µl
Serum veya plazma 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl
ID Diluent 1 - - - 25 µl
*15 dakika 37ºC'da inkübe edilir.

Soğuk aglutinin:

Kullanılan Kart ve Test Hücresi, NaCl/Enzyme/Cold agglutinin -ID-Diacell I+II+III

MİKROTÜPLER
  1 2 3 OTOKONTROL
Test cell I (DIACELL-I) 50 µl - - -
Test cell II (DIACELL-II) - 50 µl - -
Test cell III (DIACELL-III) - - 50 µl -
Eritrosit Süspansiyonu - - - 50 µl
Serum veya plazma 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl
*15 dakika +4ºC'da inkübe edilir.

Tüm kartlar santrifüj edilir ve değerlendirilir. (Bakınız antikor tarama testlerinde değerlendirme)

DEĞERLENDİRME

* Değerlendirme ID-Diacell kutusundaki antijen tablolarını kullanınız. Her değerlendirme öncesi olası bir hatayı engellemek için Test cell şişesi üzerindeki "Lot no" ile antijen tablosunun "lot no" karşılaştırınız, aynı lot numaralarını taşıdıklarından emin olunuz.
** ID-antikor tarama kartlarına test hücreleri ile aglutinasyon oluşup oluşmadığını ve reaksiyon şiddetini kaydediniz. (Pozitif veya Negatif)

  1. Kullanılan test hücreleri ile aglutinasyon oluşmamış ise ID-Diacell antijen tablosunda pozitif olduğu belirtilen antijenlere karşı antikor olmadığı düşünülmelidir.
  2. Test hücrelerinden herhangi birisi ile aglutinasyon oluşmuş ise antikor tarama testi pozitiftir. Antijen tablosunun pozitif olması muhtemel antikorlar saptanır ve antikor tanımlama testi çalışılır.

Örnek: ID-Diacell I+II (Lot no:0611.76.AO)

TEST HÜCRESİ POZİTİF OLMASI MUHTEMEL ANTİKOR*
DIACELL-I DIACELL-II  
Pozitif Negatif C, e, Fya, Jka, Lea, PI, M, S
Pozitif Pozitif D, K, Kpb, Jsb, N, s, Lub
Negatif Pozitif E, c, K, Fyb, Jkb, Leb
Negatif Negatif Diacell I+II'deki antijenlere karşı antikor yok. Ancak düşük olasılıkla Cw, Kpa, Jsa, Lua olabilir
  1. Antikor tarama testinde Diacell I+II+III kullanıldı ise değerlendirme benzer şekilde yapılarak olası antikorlar saptanır. Test hücresi sayısı arttıkça muhtemel antikoru tanımlama kolaylaşır. Ancak yine de pozitif testlerde antikor tanımlama testi yapılmalıdır.
  2. Enzim testde test hücrelerinin yüzeyindeki Duffy (Fya, Fyb), MNS (M,N,S,s) ve Xga antijenleri tahrip olmuştur. (Antijen tablosunda gölgelendirilmiş sütunlar). Bu nedenle bu antijenlere ait antikorlar enzim testi ile gösterilemez. Diğer taraftan yine enzim testinde özellikle Rh ve Kidd sistemlerine ait antikorların aglutinasyon şiddetinde artma olur. İndirekt Coombs ve Enzim tanı kriteri olarak kullanılmalıdır.
  3. Değerlendirme sırasında birden çok antijenin aynı anda bulunabilme olasılığı akılda bulundurulmalıdır. Çoklu antikor varlığında aglutinasyonun şiddetinde hiçbir değişme olmayabilir.

Yöntem: ID ile Antikor Tanımlama

ID Kartları; LISS/Coombs.. . . . . . . . . İndirekt Coombs testi
NaCl/Enzyme/Cold agglutinins . . . Enzim test ve soğuk agglutinin

ID Test Hücreleri

ID-Diapanel İndirekt Coombs, Soğuk agglutinin
ID-Diapanel Enzim test

ID-Diluent 1: Enzim testinde otokontrol mikrotüpüne eklemek için kullanılır. Bromelin solusyonudur.
ID-Diluent 2: Otokontrol için eritrosit süspansiyonu hazırlamak amacı ile kullanılır. LISS solusyonudur.

Örnekler:

  1. Test için hasta serum veya plasması
  2. Otokontrol için tam kan

TESTİN YAPOILIŞI

* İndirekt Cooombs test ve enzim test için tüm materyal oda ısısına gelene kadar beklenmelidir. ** Soğuk aglutininler için tüm materyal, kan örnekleri ve ID-Kartlar buzdolabına kaldırılmalıdır.

ERİTROSİT SÜSPANSİYONU
ID-Diluent 2 . . . . . . .1 ml
Kan................. . . .10 µl
İyice karışması sağlanır.

TEST

  1. Her test edilecek sistem (İndirekt Coombs, Enzim, Soğuk aglutinin) için uygun kartlar seçilir.
  2. Kartların üzerine hasta adı kaydedilir.
  3. Mikrotüpler kullanılacak hücrelere göre tanımlanır. Bu işlem çalışırken veya değerlendirirken olası karışıklıklara engel olur.
  4. Her test için iki kart kullanılır. İlk 11 mikrotüpte test hücreleri, 12.mikrotüpte ise otokontrol çalışılır.

    İndirekt Coombs testi:

    LISS/Coombs kart - ID-Diapanel

    MİKROTÜPLER

      1 - 11 OTOKONTROL
    ID-Diapanel (Her mikrotüpe uygun test hücresi) 50 µl -
    Eritrosit Süspansiyonu - 50 µl
    Serum ve Plazma 25 µl 25 µl
    *15 dakika 37ºC'da inkübe edilir.

    Enzim Testi:

    NaCl/Enzyme/Cold agglutinin kart - ID Diapanel P

    MİKROTÜPLER

      1 - 11 OTOKONTROL
    ID-Diapanel P (Her mikrotüpe uygun test hücresi) 50 µl -
    Eritrosit Süspansiyonu - 50 µl
    Serum ve Plazma 25 µl 25 µl
    ID Diluent 1 - 25 µl
    *15 dakika 37ºC'da inkübe edilir.

    Soğuk aglutinin:

    NaCl/Enzyme/Cold agglutinins - ID-Diapanel

    MİKROTÜPLER

      1 - 11 OTOKONTROL
    ID-Diapanel (Her mikrotüpe uygun test hücresi) 50 µl -
    Eritrosit Süspansiyonu - 50 µl
    Serum ve Plazma 25 µl 25 µl
    ID Diluent 1 - 25 µl
    *15 dakika +4ºC'da inkübe edilir.
  5. Tüm kartlar santrifüj edilir ve değerlendirilir. (Bakınız antikor tarama testlerinde değerlendirme)

ANTİKOR TANIMLAMA TESTLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ

* Değerlendirmede ID-Diapanel kutusundaki antijen tablolarını kullanınız. Her değerlendirme öncesi olası bir hayatı engellemek için Test cell şişesi üzerindeki "Lot no" ile antijen tablosunun "lot no" karşılaştırınz, aynı lot numaralarını taşıdıklarından emin olunuz.

  1. LISS/Coombs, enzim test ve soğuk aglutinin testlerindeki aglutinasyon şiddetleri antijen tablosuna kaydedilir.
  2. Değerlendirmeye aglutinasyon görülmeyen ilk hücre ile başlanır. Bu hücrede bulunduğu belirtilen (+ işareti ile gösterilen) antijenler çizilir. Serumdaki antikor bu antijenlerle aglutinasyon oluşturmadığına göre, bu antijenlere karşı gelişmiş olamaz.
  3. Bu işlem aglutinasyon görülmeyen tüm hücreler için tekrarlanır.
  4. Olası antijenler saptandıktan sonra, test sonuçları bu antijenlere ait sütunlarla kıyaslanır. Bir antijen modeline uyan reaksiyon sonucu, muhtemel antikor olabilir.
  5. Enzim testde test hücrelerinin yüzeyindeki Dufy (Fya, Fyb), MNS (M,N,S,s) ve Xga antijenleri tahrip olmuştur (Antijen tablosunda gölgelendirilmiş sütunlar). Bu nedenle bu antijenlere ait antikorlar enzim test ile gösterilemez. Diğer taraftan yine enzim testinde özellikle Rh ve Kidd sistemlerine ait antikorların aglutinasyon şiddetindeki değişim özellikle tanı kriteri olarak kullanılmalıdır.
  6. Bir antikoru tanımlamak için sadece reaksiyon modeline (bir anitjen sutünuna tam benzerlik) bağlı kalmak yanıltıcı sonuçlara neden olabilir. Herhangi bir antikor heterozigot hücrelerle reaksiyon vermemiş olabilir (dozaj). Bazı olgularda iki veya daha fazla sayıdaki antikor, tek bir antikora uyan reaksyon modeli gösterebilir. Burden çok sayıda antikor varlığında reaksiyon şiddetlerinin değişik olması gerekmez.
  7. Birden fazla antikor varlığı:
    1. Aglutinasyon paterni tek bir antikor varlığı ile açıklanamıyorsa,
    2. Farklı testlerde elde edilen sonuçlar birbirlerini desteklemiyorsa
    3. Aglutinasyon şiddetlerindeki fark dozajla birden çok antikor varlığı düşünülmelidir.

Yöntem: OTOANTİKOR POZİTİF OLGULARDA ALLOANTİKORLARI GÖSTEREBİLMEK İÇİN ADSORBSİYON

Prensip: Sıcak tipte otoantikor pozitif olgularda bu antikorlar tarama testlerinde kontrol tüpü pozitif bulunan olgularda öncelikle otoantikorların adsorbe edilerek ortamdan uzaklaştırılmas gerekir.
Materyal:

  1. %6 Bovine albümin: %22'lik veya %30'luk bovin albuminden serum fizoyolojik ile sulandırılarak hazırlanır.
  2. %1 Cysteine-ile aktive edilmiş papain:
  3. Otoantikor içeren kan örnekleri

TEST

  1. 2 ml 4 kez serum fizyolojik ile yıkanır. Supernatan atılır.
  2. Üzerine eşit miktarda (2 ml) %6 bovin albumin eklenir. İyice karıştırılır.
  3. Benmaride 56C'da 3-5 dakika inkübe edilir. Bu süre boyunca tüp yavaşça sallanır.
  4. 2 dakika 1000 g'da santrifuj edilir. Supernatan bir tüpe alınarak saklanır (eluate olarak kullanılabileceği için).
  5. Eritrositler 3 kez serum fizyolojik ile yıkanır. Supernatan atılır.
  6. Eritrositlerin üzerine 1 ml %1 papain solusyonu eklenir. İyice karıştırılır 37C'da 15 dakika inkübe edilir.
  7. Eritrositler 3 kez serum fizyolojik ile yıkanır. Son yıkamada en az 5 dakika santrifuj edilmelidir. Supernatant tamamen atılır.
  8. Yıkanmış eritrositler ikiye bölünür.
  9. Eritrosit bulunan tüplerden ilkine 2 ml hastanın serumu eklenir. Karıştırılır ve 30 dakika 37C'da inkübe edilir.
  10. 2 dakika 1000 devirde santrifüj edilir. Üstteki serum ikinci eritrosit süspansiyonu tüpüne eklenir ve karıştırıldıktan sonra 30 dakika 37C'da inkübe edilir.
  11. 2 dakika 1000 devirde santrifüj edildikten sonra elede edilen serum antikor tanımlama kullanılır. Halen kontrol tüpü pozitif ise işlem başarısız olmuştur. Kontrol tüpü negatif ise tanımlanan antikor alloantikordur.
    Eluate'nin kullanımı: Madde 4'de elde edilen supernatan (hasta eritrositleri tamamen uzaklaştırılmış olmalı) hasta eritrositlerin yüzeyini kaplayan otoantikorlardır. Bu kullanılarak yapılacak antikor tanımlama testi otoantikorun hangi antijene karşı oluştuğunun saptanmasını yarcımcı olur.
Yöntem: ID ile ANTİKOR TİTRASYONU

ID-Kartlar: LISS/Coomos . . . . . . . . . . indirekt coombs testi pozitif ise
NACI/Enzyame/cold aglutinin . . Enzim test pozitifliği, soğuk aglutinin varlığı veya anti-A ve anti-B için
ID-Test Hücresi:
Antikor tanımlama testinin pozitif sonuç bulunan antijen ile ilişkili test hücresi ID-Diacell I+II+III veya Diapanel'den seçilebilir.
Homozigot veya heterozigot hücreler kullanılabilir.
Enzim testi pozitif ise titrasyonda papainize hücreler kullanılır (Diacell I+II+III P veya Diapanel P)
ID-Diluent 2: Serum veya plasmanın dilusyonunda kullanılır.
Örnek:
Serum veya plasma

TESTİN YAPILIŞI:

SERUM DİLUSYONU:

Dilusyon cam veya plastik tüplerde yapılır.

  1 2 3 4 5...
ID-Diluent 2 - 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl...
Serum veya plasma 100 µl 100 µl ile seri dilüsyon . . . . .
TİTRE 1/1 1/2 1/8 1/16 ....
*1/1 ile 1/1024 arası titreler kullanılır.

TEST

  1. Her hasta için iki kart kullanılır. Her mikrotüpün hangi titreye ait olduğu kart üzerinde belirtilir. (Daha ekonomik olması için ilk aşamada 1/1 ile 1/32 titreler çalışıp eğer pozitiflik devam ediyorsa ikinci aşamada 1/64-1/1024 titreler çalışabilir.)
  2. Antikor tanımlama testinde pozitif bulunan antikora uygun kart ve test hücresi seçilir.
  3. Tüm mikrotüplere 50µl eklenir.
  4. Her mikrotüpe uygun dilue serum 25µl eklenir.
  5. Enzim ve Coombs test için 37C'da, soğuk aglutininler +4C'DA 15 dakika inkübe edilir (Soğuk aglutininler için kart test hücresi ve serum test öncesi buzdolabına konulmamış ise inkubasyon 30 dakika olmalıdır.)
  6. Santrifuj edilir ve değerlendirilir.

DEĞERLENDİRME:

Mikrotüplerdeki aglutinasyon ++++,+++,++,+ ve - olarak tanımlanır.
Aglutinasyon şiddetinin pozitif olduğu son tüp titreyi gösterir.

Yöntem: ID ile Eritrositlerin Papain ile Hazırlanması

Cross-match, antikor tarama ve tanımlama için hücrelerin papainizasyonu amacı ile yapılır.

Materyal:

  1. ID-Papain: Kullanıma hazır sıvı solusyon
  2. ID-cellwash-P: Papainize hücreleri yıkamak için kullanılır.
  3. ID-cellstab: Hazırlanan papainize hücrelerin 4 hafta süre ile stabilitesini korur.

İŞLEM

  1. Eritrositler 3 kez serum fizyolojik ile yıkanır ve supernatan atılır.
  2. Suspansiyon:
    Yıkanmış sediment . . . . . . . . . . . . . . . . 50µl
    Serum fizyolojik . . . . . . . . . . . . . . . 0.9 ml
    ID-Papain . . . .. . . . . . . .. . . . . . . . . 1 m
  3. 5 dakika oda ısısında bekletilir.
  4. İki kez ID-Cellwash ile yıkanır ve supernatan atılır.
  5. %0.8 eritorist suspansiyonu hazırlanır.
    Papainize eritrosit . . . . . . . . . . . . . . . . . 50µl
    ID-cellstab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5ml

* Papainize hücreler steril flakonlarda saklanmalıdır.

ID Kartlarda Kullanılan Coombs (AHG) Serumları
ID KART COOMBS SERUMU KULLANIM ALANI
LISS Coombs Polispesifik Antikor tarama
Antikor tanımlama
Cross-match
Direkt Coombs testi
Coombs/Enzyme Polispesifik (3 tüp) Antikor tarama
Crossmatch Polispesifik (2 tüp) Crossmatch
Reverse grouping ab screening Polispesifik (2 tüp) Reverse gruplama ve antikor tarama
Direk Coombs testi
Coombs IgG Polispesifik-IgG Direkt Coombs-yenidoğan
Anti-D titrasyon
Crossmatch
DC Screening Monospesifik
Anti-IgG, Anti-IgM
Anti-C3, Anti-C3d
Anti-C4-polisp
Direk Coombs
Sınıflama
İndirek Coombs
Sınıflama
POLİSPESİFİK COOMBS SERUMU: Anti-IgG ve Anti-C3d içerir.
COOMBS IgG: Anti-IgG içerir (Anti-kompleman yoktur). Anti Ig-G ve IgA ve IgM hafif zincirine karşı etki gösterir.
ANTİ-C3: Anti-complement C3b ve C3d içerir
ANTİ-C4: Anti-complement C4b ve C4d içerir.

3. ÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMA
(CROSS-MATCH, UYGUNLUK TESTİ)

Kan gruplarının saptanması:

Alıcıda ABO/Rh tayini yeterlidir. Rutin olarak Rh subgruplarının çalışılmasına ihtiyaç yoktur. Ancak hastada talasemia, aplastik anemi gibi sürekli kan transfüzyonuna ihtiyaç gösterebilecek bir hastalık varsa Rh subgruplarının saptanması ve fenotipik olarak benzer kanların verilmesi, bu hastalarda antikor oluşumuna bağlı takip eden transfüzyonlardaki cross-match problemlerine engel olur. Cross-match öncesi donör ve alıcı kan gruplarının doğrulanması olası hatalardan korunmak için çok yararlıdır.

Antikor tarama:
Antijenik yapıları bilinen hücreler kullanılarak reverse gruplama ve antikor tarama testi yapılması uygun olur. (Bakınız Reverse gruplama ve antikor tarama testi)

UYGUNLUK TESTİ (CROSS-MATCH)

  1. Majör cross-match: Alıcı serum veya plazması ile donör eritrositleri kullanılarak yapılır. Alıcıda antikor tarama testi negatif olmasına rağmen bazı durumlarda cross-match uygun bulunmayabilir.
    1. Antikor tarama testlerinde antijenik yapısı biline 2-3 ayrı donörden alınmış test hücreleri (Diacell I-II veya Diacell I+II+III) kullanılır. Tarama testlerinde klinik önemi olan tüm antikorların saptanabilmesi mümkün değildir. Bu tür durumlarda diapanel (11 test hücresi vardır) kullanılması antikorun tanımlanmasında yardımcı olur.
    2. Kan bankasının antikor taramak amacı ile kullanıldığı test yeterince hassas olmayabilir.
  2. Minör cross-match: Alıcının eritrositleri ve donörün serum veya plazması kullanılarak yapılır. Ancak transfüzyon öncesi yapılması gerekli değildir. Donörden alınan anamnezde klinik olarak önemli antikorların oluşma olasılığı varsa (daha önce transfüzyon yapılması vs.) reverse gruplama ve antikor tarama testinin yapılması, antikor pozitif kanların komponent hazırlanmasında kullanılması daha doğru bir yaklaşımdır.
  3. Enzim tekniği ile cross-match: Enzim tekniği antikor tarama ve tanımlama çalışmalarında cross-match'den daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Daha duyarlı bir cross-match isteniyorsa kullanılmaktadır. Enzimle cross-match özellikle Rh ve Kidd sistemleri ile ilişkili antikorlarda duyarlılığı belirgin şekilde artırır. Ancak tek başına kullanılmamalıdır. Enzimle muamele sonrası MNS ve Duffy sistemlerine ait antijenler tahrip olur. Bu sistemlere ait uygunsuzluklar bu nedenle enzimle cross-match'de gösterilemez. Mutlaka majör cross-match ile birlikte yapılmalıdır.
  4. Otokontrol: Eğer alıcıya yakın zamanda transfüzyon yapılmış ise otokontrol veya direkt Coombs testinin yapılması gerekir. Otokontrolün çalışılması otoimmün fenomenlerin açığa çıkarılmasına yardımcı olur. Ayrıca yakın zamanda transfüzyon yapılmış hastalarda yeni oluşan antikorların tümü eritrositlerin yüzeyini kaplamış ve bu nedenle serumda saptanamamış olabilir. Ancak otokontrolün gerekli olmadığını düşünen araştırmacılarda vardır.

Tablo: Eritrosit Alloantikorlarının Özellikleri ve Uygun Donör Seçimi

Antikor İMMÜNOGLOBULİN TEST HEMOLİZ DONÖR
  IgM IgG IgA NaCl Alb Coombs Enz In vitro Alıcı Y.Doğan  
B 3 1 1 4       2 4 2 A,0
A1 4     4             A2,0
A 3 1 1 4       2 4 2 B,0
A, B 4     4       1 4   0
H 4     4       3   0 Oh*
                       
D 1 3 1 1 3 3 3 0 3 4 D-
C 1 3   1 3 3 3 0 2 1 C-
CW 2 2   1 3 3 3 0 2 2 Cw-
C   3     3 3 3 0 1 1 c-
E 1 3   1 3 3 3 0 2 2 E-
e   3     3 3 3 0 1 1 e-
                       
K 1 3   1   3 3 0 2 2 K-
k   4       3 3 0 1 1 K-*
Kpa   4       3 3 0 1 1 Kpa-
Kpb   4       3 3 0 1 1 Kpb-*
Jsa   4       3 3 0 1 1 Jsa-
Jsb   4       3 3 0 1 1 Jsb-*
                       
Fya 1 4   1 3 3 0 0 1 1 Fya-
Fyb   4     3 3 0 0 1   Fyb-
                       
Jka   4       3 3 0 1 1 Jka-
Jkb   4       3 3 0 1 1 Jkb-
                       
Lea 3 1   3   2 3 2 1 0 Lea-
Leb 4     4   3 3 1 1 0 Leb-
                       
P1 3     3       1 2 0 P1-
                       
M 3 1   3   1 0 0 1 1 M-
N 3 1   3     0 0 0 0 N-
S 2 2   3   1   0 1 1 S-
s 1 3       3   0 2 1 s-
                       
Lua 3 1   3       0   1 Lua-
Lub 3 1 1 3       0 1   Lub-*

4: Olguların hemen hemen tümünde
3: Olguların çoğunda
2: Olguların bazılarında
1: Olguların az bir bölümünde
0: yok
* Beyaz ırkta bu antijenleri taşımayan birey oranı %0.1'den az

Yöntem: ID ile Cross-match

ID-Kart:
Cross-match . . . . Her kart bir ünite kan hazırlamak için

ID-Diluent1: Bromelin solusyonudur.
ID-Diluent2: LISS Solusyonudur. Eritrosit suspansiyonu hazırlamak için kullanılır.

Örnekler: Donör eritrositleri Alıcının serum veya plazması

TESTİN YAPILIŞI:

ERİTROSİT SÜSPANSİYONLARI
Donörün ve Alıcının eritrosit süspansiyonları hazırlanır.
ID-Diluent 2 . . . . . . . . .1ml
Konsantre eritrosit. . . . . .10 µl
İyice karıştırılır.

TEST:

  1. Cross-match kartı üzerine alıcının adı ve donörün numarası yazılır.
  2. Donör eritrosit süspansiyonu 50 µl 1,2,3,4, ve 5'nci mikrotüplere dağıtılır. (A,B,D, Enz, AHG-Coombs)
  3. Alıcı eritrosit süspansiyonu 50 µl 1,2,3 ve 6'ncı mikrotüplere dağıtılır. (A,B,D,AHG-otokontrol)
  4. Alıcı serum veya plazması 25 µl 4,5 ve 6'ncı mikrotüplere dağıtılır. (ENZ, AHG-Coombs, AHG-otokontrol)
  5. ID-Diluent 1 25ìl 1,2,3 ve 4'ncü mikrotüplere dağıtılır (A,B,D,Enz)
  6. 37 °C'da 10-15 dakika inkübe edilir.
  7. Santrifüj edildikten sonra değerlendirilir.

DEĞERLENDİRME:

  1. İlk üç mikrotüpde donör ve alıcının kan gruplarının uygun olup olmadıkları kontrol edilir. Pozitif ve negatif reaksiyonlar net olmalıdır. Yani pozitif mikrotüplerde tabanda hiç eritrosit bulunmamalıdır. Aynı şekilde negatif mikrotüplerde de yüzeyde eritrosit bulunmamalıdır.
  2. Eğer donör ve alıcının kan grupları aynı değil ise çift eritrosit popülasyonuna bağlı olarak aynı mikrotüpte hem pozitif hemde negatif reaksiyon görülür. Çift eritrosit popülasyonu A,B ve D mikrotüplerinde çok açık olarak ayırt edilebilir. Aglutinasyona katılmayan hücreler konik tabana çökerken, kuvvetli aglutinasyon oluşturan hücreler mikrotüp yüzeyinde çok net olarak ayırt edilen aglutinasyon oluşturan hücreler mikrotüp yüzeyinde çok net olarak ayırt edilen bir tabaka oluşturur. Çift eritrosit popülasyonlarında negatif reaksiyon alışılagelmiş olana göre daha zayıf olabilir.
  3. Cross-match'in değerlendirilmesi
  4. (Enzim) (Major cross-match) Sonuç
    - - Uygun
    + + Uygun değil
    + - Uygun değil
    - + Uygun değil
  5. Otokontrol pozitif ise otoantikor ve alloantikor araştırılır

D. DİREKT ANTİGLOBULİN (COOMBS) TESTİ (DAT)

Direkt Coombs testi hastaneye yatan hastaların yaklaşık %10'unda ve donörleri 1/1000- 1/10.000'inde immün hemoliz olmaksızın pozitif olarak saptanır. Pozitiflik çeşitli nedenlere bağlı olabilir.

  1. Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş otoantikorların komplemanla birlikte veya tek başına eritrosit yüzeyini kaplaması
  2. Yakın zamanda yapılmış bir transfüzyondan sonra alıcıdaki alloantikorların donör eritrositlerinin yüzeyini kaplaması
  3. Donörün plazmasında bulunan antikorların transfüzyondan sonra alıcı eritrositlerin yüzeyini kaplaması
  4. Annedeki alloantikorların plasentadan geçerek fetusun eritrositlerini kaplaması
  5. Çeşitli ilaçların (penisilin, sefalosporin, quinidine, phenacetin vs) kullanımına bağlı olarak
  6. Yüksek doz gamaglobilin tedavi sırasında veya hipergamaglobulinemide Direkt Coombs testinin pozitif olup olmadığı polispesifik Coombs serumu kullanılarak araştırılır. Coombs serumunun asıl önemli fonksiyonu eritrosit yüzeyini kaplayan IgG'nin varlığını göstermektir. Ancak otoimmün hemolitik anemi tanısında Anti-C3d'ye karşı olan aktivitesi de önem kazanır. IgM ve IgA ise invivo olarak nadiren eritrosit yüzeylerini kaplarlar.

Hemolitik anemilerde monospesifik Coombs serumu kullanıldığında başlıca 3 şekilde pozitiflik saptanır:

  1. Eritrositlerin yüzeyi tek başına IgG ile kaplanmıştır.
  2. Eritrositlerin yüzeyi IgG tipi antikorlara bağlı olduğu saptanan vakalarda IgG'nin altsınıflarının da araştırılması mümkündür. IgG1 en sık rastlanılan alt sınıftır. IgG1 ve IgG3 alt sınıflarına bağlı olarak gelişen hemolitik anemilerde eritrosit yaşam süresi IgG2 ve IgG4 alt sınıflarına göre daha kısalmıştır.
  3. Soğuk antikorlara (cold agglutinin) bağlı hemolitik anemilerde eritrosit yüzeyini kaplayan antikor IgM yapısındadır. Az sayıda vakada IgM ile birlikte IgA veya IgG bulunabilir. Ancak bu olguların direkt Coombs testinde genellikle koplemanlara (Anti-C3, Anti-C4) alt pozitiflik saptanır. İlaçlara bağlı hemolitik anamilerde de direkt Coombs testinde benzer şekilde sadece komplemanlara ait pozitiflik saptanır. Eritrositlerin yüzeyinde immünglobullinler bu tip hemolitik anemilerde de nadiren gösterilebilir.

Yenidogan hemolitik hastalığında da direkt Coombs testi yapılmalıdır. Tüm eritroblastosis vakalarında değişmez bir kural olarak direkt Coombs testi pozitiftir. Bu durumun tek istisnası ABO uyuşmazlıklarıdır. Bu vakalarda ancak duyarlı bir Coombs tekniği kullanılırsa zayıf pozitiflik gösterilir.

Yenidoğanlar dışında bir olguda direkt Coombs testi pozitif bulunduğunda aşağıdaki sorulara cevap aranmalıdır.

  1. Invivo hemoliz varlığını gösteren bir bulgu (Retikülositoz, anemi, hemoglobinürü, yüklenmiş LDH) var mıdır?
  2. Yakın zamanda transfüzyon yapıldı mı?
  3. Yakın zamanda ABO uygunsuz plazma veya komponentleri verildi mi?
  4. Hastada indirekt Coombs testi pozitif mi?
  5. Hasta hemolitik anemiye neden olduğu bilinen ilaçlardan herhangi birini kullanıyor mu?

Klasik tüp testinde eritrositlerin gereğinden az veya fazla yıkanmış, santrifuj süresi ve/veya hızının uygun olmaması, kullanılan Coombs serumunun kontamine olması gibi nedenlerle hatalı sonuçlar görülebilir. Bu hata kaynakları jel testinde aşikar şekilde elimine edilmiştir.

Yöntem: ID ile Direkt Coombs Testi

ID-Kartları:

LISS/Coombs . . . . . .Her kartta 6 test yapılabilirReverse gruping-ab screening (4,5 ve 6.mikrotüpler)
ID-Diluent 2: Eritrosit süspansiyonu hazırlamak için kullanılır. LISS solusyonudur.

TESTİN YAPILIŞI:

Teste başlamadan önce tüm materyaller ve kan örneklerinin oda ısısına gelmesi beklenir.

ERİTROSİT SÜSPANSİYONU ID-Diluent 2 . . . . . . . . . .1ml
Kan. . . . . . . . . . . . . . .10 µl
İyice karıştırılır

TEST:

  1. Kullanılacak karta hastanın adı yazılır
  2. Eritrosit süspansiyonu karıştırılır ve 50 µl mikrotüpe dağıtılır
  3. Santrifüj edildikten sonra değerlendirilir.

DEĞERLENDİRME:

Aglutinasyon ++++,+++,++,+ veya -, olarak kart üzerinde tanımlanır.

Yöntem: ID ile Direkt Coombs Testinde Pozitifliğe Yolaçan İmmünglobulin ve Kompleman Komponentlerinin Gösterilmesi


ID-Kartlar:

DC-Screening I . . . . . . . . IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, Ctl
DC-Screening II. . . . . . . . IgG, C3d, CH/IgG, C3d, Ctl
ID-Diluent 2: Eritrosit süspansiyonu hazırlamak için kullanılır. LISS solusyonudur.

Örnekler:

* Özel bir işlem yapılamsına gerek yoktur. Sitratlı veya EDTA'lı kanlar kullanılabilir.
** Tercihen yeni alınmış kanlarda test yapılmalıdır.

TESTİN YAPILIŞI:

Teste başlamadan önce tüm materyaller ve kan örneklerinin oda ısısına gelmesi beklenir.
Test öncesi eritrositlerin yıkanmasına gerek yoktur.
ERİTROSİT SÜSPANSİYONU ID-Diluent 2 . . . . . . . .1ml
Kan. . . . . . . . . . . . . 10 µl
İyice karıştırılır. Hazırlandıktan sonra hemen kullanılmalıdır.

TEST:

  1. Kart üzerine hastanın adı yazılır.
  2. Eritrosit suspansiyonu karıştırılır ve 50 µl tüm mikrotüplere dağıtılır.
  3. Santrifüj edildikten sonra değerlendirilir.

DEĞERLENDİRME:

Aglutinasyon ++++,+++,++,+ veya -, olarak kart üzerinde tanımlanır.
  1. Negatif kontrol tüpünde daima negatif reaksiyon görülmelidir. Eğer negatif kontrol pozitif ise eritrositler 37 C'a kadar ısıtılmış serum fizyolojik veya ID-Dilüent 2 ile yıkanır. Daha sonra test yukarıda belirtilen şekilde tekrar çalışılır.
  2. Eğer tüm mikropütlerde pozitif reaksiyon görülürse Kuvvetli IgM otoantikorların var olduğu düşünülür.
  3. Monospesifik Coombs serumlarından herhangi birisi pozitif ise polispesifik Coombs serum mikrotüpü de pozitiftir.
  4. Anti-IgG pozitif ancak Anti-C3d negatif ise eritrosit yüzeyi IgG yapısında otoantikorlarla kaplanmıştır. Extrevasküler hemoliz olasılığı vardır.
  5. Anti-IgG ve Anti-C3d birlikte pozitif ise ve IgG yapısında otoantikorların var olduğu düşünülür, intravasküler hemoliz eğilimi vardır.
  6. Sadece Anti-IgA pozitifliği IgA otoantikorlarının varlığını gösterir. Ancak anti-IgG olmaksızın tek başına anti-IgA pozitifliği nadirdir.
  7. Sadece Anti-C3d pozitifliği soğuk otoantikorların varlığını düşündürmelidir.
  8. Anti-C3 pozitifliğinin hangi antijene bağlı olduğu Diacel I+II+III veya Diapanel kullanılarak gösterilebilir.
  9. Anti-IgG pozitifliğinin hangi antijene bağlı olduğu Diacel I+II+III veya Diapanel kullanılarak gösterilebilir.
  10. Eritrosit süspansiyonu hazırlanırken eritrositlerin fazla miktarda alınması hatalı pozitif sonuçlara neden olabilir. Kullanılan pipetlerin kontrolleri düzenli olarak yapılmalıdır.
  11. Kan örneklerinin bakteri veya diğer maddelerle kontamine olması hatalı pozitif veya negatif sonuçlara neden olabilir.
Yöntem: ID ile Direkt Coombs Pozitif Olgularda Kan Gruplarının Saptanması- IgG ile Kaplı Eritrositler(Yöntem 1)

Prensip:
Chloroquine IgG'nin eritrosit yüzeyinden ayrılmasını sağlar. Ancak kompleman kompenentlerini eritrositten ayyrmaz. Bu nedenle IgG ve komplemanın birlikte kaplandığı olgularda yetersiz kalır.

Materyal:

  1. Chloroquine diphosphate solusyonu: Chloroquine diphosphate (Sigma c-6753) . . 2g
    Serum fizyoloji. . . . . . . . . . . . . . 10ml
    *pH 5.1 olacak şekilde 1 N NaOH eklenir.
    *solusyon buzdolabında saklanır.
  2. Anti-IgG antiglobulin reagent (anti-IgG tipi Coombs serumu)
  3. Kontrol eritrositleri
  4. IgG ile kaplı hastaya ait eritrositler

TEST:
Test hasta ve kontrol eritrositlerinde aynı şakilde çalışır.

  1. Eritrositler en az 3 kez yıkanır.
  2. Yıkanmış eritrosit....................0,2ml
    Chloroquine disposphate solusyonu. .0,8ml
  3. Karıştırıldıktan sonra oda ısısında 30 dakika inkübe edilir.
  4. Birkaç damla hasta eritrositi bir tüpe alınır, 4 kez serum fizyolojik ile yıkanır.
  5. İnta-IgG Coombs serumu ile direkt Coombs testi çalışılır.
    1. Coombs testi pozitif ise inkübasyona devam edilir. Her 30 dakikada bir işlem tekrarlanır. Maksimum inkübasyon süresi 2 saattir, iki saatten uzun sürerse veya inkübasyon 37C'da yapılırsa hemoliz oluşur. Ayrıca eritrosit antijenlerinin bir bölümü de tahrip olur.
    2. Eğer Coombs testi negatif ise hasta ve kontrole ait kanlar 3 kez serum fizyolojikle yıkanır.
  6. Elde edilen eritrositlerle hasta ve kontrol kanında kan grupları çalışılır.
KONTROL KANINDAKİ BULGULAR ÇALIŞMA ÖNCESİ BULGULARLA KARŞILAŞTIRILIR. UYUMLU İSE HASTA KAN GRUBUNUN DOĞRU TANIMLANDIĞI DÜŞÜNÜLÜR.
Bazı RH antijenleri bu işlem sırasında tahrip olabilir. Bu tür hataları fark edebilmek için mutlaka kontrol kanı ile hasta kanı aynı koşullarda çalışılmalıdır

Yöntem: ID ile Direkt Coombs Pozitif Olgularda Kan Gruplarının Saptanması- IgG ile Kaplı Eritrositler( Yöntem 2)

Prensip:
Isı etkisi ile eritrosit yüzeyini kaplayan IgG'ler eritrosit yüzeyinden uzaklaştırılırlar.

Materyal:

  1. Kontrol eritrositleri
  2. Anti-IgG antiglobulin reagent (anti-IgG tipi Coombs serumu)

TEST:
Test hasta ve kontrol eritrositlerinde aynı şekilde çalışılır.

  1. Eritrositler en az 3 kez yıkanır.
  2. Yıkanmış eritrosit . . . . . . 1 hacim
    Serum fizyolojik . . . . . . . 3 hacim
  3. Karıştırıldıktan sonra 45C'da (benmari veya etüv) 30 dakika inkübe edilir.
  4. Santrifüj edilir. Supernatan atılır.
  5. Anti-IgG Coombs serumu ile direkt Coombs testi çalışılır.
    1. Coombs testi pozitif ise inkübasyona devam edilir. İşlem tekrarlanır.
    2. Eğer Coombs testi negatif ise hasta ve kontrole ait kanlarda kan grupları çalışılır.
KONTROL KANINDAKİ BULGULAR ÇALIŞMA ÖNCESİ BULGULARLA KARŞILAŞTIRILIR. UYUMLU İSE HASTA KAN GRUBUNUN DOĞRU TANIMLANDIĞI DÜŞÜNÜLÜR.
Bazı Rh antijenleri bu işlem sırasında tahrip olabilir. Bu tür hataları fark edebilmek için mutlaka kontrolkanı ile hasta aynı koşullarda çalışılmalıdır.
*Çok acil durumlarda veya 45C'da başarılı olunamamamışsa inkübasyon 56 C'da 3 dakika olarak yapılabilir. Ancak 3 dakikadan fazla tutulmamalı, eritrosit yüzey antijenleri tahrip olur.

Yöntem: ID ile Direkt Coombs Pozitif Olgularda Kan Gruplarının Saptanması- IgM ile Kaplı Eritrositler

Prensip:
2-Mercaptoethanol IgM molekillerinde disulfide bağlarını koparır.

Materyal:

  1. 0.1 M 2-Mercaptoethanol
  2. Mercaptoethanol . . . . . . . . . . . 70 µl
PBS . . . . . . . . . . . . . . . . . 9930 µl STOK SOLUSYONU: Buzdolabında saklanır. NaH2PO4.H20. . . . . . . . . . . . . . 0.665gr Na2HP04. . . . . . . . . . . . . . . . 25.5gr Distile su . . . .Hacim 300 ml'ye tamamlanır. ÇALIŞMA SOLUSYONU Stok Solusyon. . . . . . . . . . . . . 1.5 ml Distile su . . . . . . . . . . . . . .13,5 ml

TEST:

  1. Eritrositler en az 3 kez serum fizyolojik ile yıkanır.
  2. Yıkanmış eritrosit . . . . . . . . 100 µl
    PBS. . . . . . . . . . . . . . . . 100 µl
  3. Eritrosit suspansiyonunun üzerine 200 µl 0.1M 2, Mercaptoethanol solusyonu eklenir.
  4. 37C'de 10 dakika inkübe edilir.
  5. Eritrositler 3 kez yıkanır. Kan gruplarının tesbitinde bu eritrositler kullanılır.

Yöntem: Direkt Coombs Pozitif Olgularda Otoantikorların DiaCidel ile Asit Elusyonu

Direk antiglobulin (Coombs testinin) -DAT'ın- amacı eritrositlerin otoantikorlarla kaplı olup olmadığını tespit etmektir. Pozitif DAT'ın bulunduğu yerlerde başka testler yapılmalıdır:

  • antikor sınıfından IgG, IgM, IgA'nın; C3d ve C3c komplemanlarının ayrılması
  • otoantikorun tanımlanması

Otoantikor sınıfının ayrılması, anti-IgG, -IgM, -IgA, -C3d ve -C3c monospesifik AHG reajentleriyle DAT prosedürü ile uygulanır. Tanımlama için, ılık reaktif antikorlar için en uygun elusyon yöntemi kabul edilen asit elusyon işlemi gibi bir elusyon yöntemi kullanılarak antikorlar eritrositlerden ayrılır.

DiaCidel, en çok bilinen otoantikorlar için rahat çalışma ortamı sağlayan kullanıma hazır reajentler içerir.

Reajentler
Sadece in vitro teşhis kullanımı için.

  • DiaCidel, yıkama solüsyonu (konsantre), 30 ml'lik vial'larda, koruyucu olarak sodyum-asit'in bulunduğu Glysin-NaCl (%1.0) buffer'ı içerir.
    2-8 C'de saklayınız.
    Miyadı için etikete bakınız.

    Çalışma Solüsyonunun Hazırlanması:
    konsantre Yıkama solüsyonunu damıtılmış suda 1:10 oranında dilüe edin
    (1 birim konsantre+9 birim su)
    Çalışma solüsyonunun dayanırlılığı: kapalı bir şişede 2-8 C'de 6 ay.

  • renk göstericisiyle düşük pH'lı glysin buffer, içeren kullanıma hazır DiaCidel, Elusyon solüsyonu, 10 ml'lik viallarda
    2-8 C'de saklayınız
    Miyadı için etikete bakınız

Diğer gerekli malzemeler

  • Süspansiyon için tüpler
  • Tüp tutucusu
  • Pipet
  • Santrifüj

Örnek materyal
Örnek almak için hastanın özel bir hazırlık yapmasına gerek yok. Uygun phlebotomy teknikleri kullanarak kan örnekleri alın. Kompleman komponentlerinin in vitroda yükseltilmesinin sonucu olarak pozitif DAT'ı önlemek için kan örnekleri tercihen EDTA'lı tüplere alınmalıdır.
Güvenilir sonuçlar için, taze alınmış kanın kullanımı gereklidir.

Elusyon Prosedürü

  • %0.9'luk izotonik salin solüsyon ile bir kere pozitif DAT vermiş olan eritrositleri yıkayın. En az 1.0 ml sıkıştırılmış hücre gereklidir.
  • Sıkıştırılmış hücrelerin 1.0 ml'sini DiaCidel çalışma yıkama solüsyonu ile 4 kere yıkayın.
  • Son yıkamadan sonra tortusunu iyice ayırın ve normal olmayan antikorların varlığını test etmek için süpernatantın bir kısmını saklayın (dikkat edilecek noktalar 1'e bakınız).
  • 1.0 ml'lik sıkıştırılmış hücrelere 1.0 ml DiaCidel elusyon solüsyonu ilave edin. İyice karıştırın.
  • Hemen 900 g'de 1 dakika santrifüj edin
  • Eluat'ı temiz bir tüpe geçirin
  • Eluat'a 5 damla DiaCidel buffer solüsyonu ilave edin ve iyice karıştırın. Mavi rengin oluşmasını izleyin, nötral pH 6.5-7.5'e ulaştığını belli eder. Eğer mavi renk elde edilemezse, karıştırırken bir miktar daha buffer ekleyin (her seferinde 1 damla)
  • Artık hücreleri tamamen ayırmak için eluat'ı 1 dakika 900 g'de santrifüj edin
  • Şimdi eluat test için hazır
Antikorun ortaya çıkarılması ve tanımlanması için kullanılan normal prosedürü eluatla uygulayın; negatif kontrol olarak, paraleldeki son yıkamadan kalan süpernatant solüsyonu kullanın.

Sonuçların yorumlanması
Eluatla test hücrelerinin agglutine olması ve kontrol tüpünde agglutinasyon olmaması, antikorların eritrosit yüzeyinden elüe edildiğini gösterir. Antikoru tanımlamak için her zamanki tekniği kullanın.
Eluatla test hücrelerinin agglütine olmaması, hiçbir antikorun elüe olmadığını veya karşılığı olan antijenin test hücrelerinde bulunmadığını gösterir.

Dikkat edilecek noktalar

  1. Son yıkamadaki süpernatantın reaktivitesi, elusyon için yetersiz yıkamaya bağlı olarak kontaminasyon gösterebilir. Ancak, aynı zamanda yıkama prosedürü esnasında elüe edilmiş az meyilli antikorların varlığını da gösterebilir. Bu durumda, elusyon prosedürü, soğutulmuş reajentler ve test örnekleri kullanılarak tekrar edilmelidir.
  2. Eluatla pozitif DAT'ı takip eden negatif reaksiyon ayrıca asit elusyon prosedürü kullanılırken kaplayan globulinlerin eritrositlerden uzaklaştırılamadığını gösterir. Bu durumda, diğer elusyon metodlarının kullanımı değerlendirilmelidir.
  3. Eğer test hemen yapılmazsa, eluat 2-8 C'de 7 güne kadar saklanabilir. Ancak, beklerken eğer eluat bulanırsa, daha fazla kullanılamaz.

Sınırlamalar

  • Malzemelerin, bakteriel veya diğer kontaminasyon durumlarında kullanılması yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlara neden olabilir.
  • Prosedürlere ve önerilen malzemelere tamamen uymak gereklidir. Aletler, GLP prosedürlerine göre düzenli olarak kontrol edilmelidir.

E. YENİDOĞANIN HEMOLİTİK HASTALIĞI VE JEL TEKNOLOJİSİ

İnsan eritrositlerinin üzerinde A/B antijenlerinin varlığının tespiti için anti-A, anti-B, anti-AB test kitlerine ihtiyaç vardır. A ve B antijenleri doğumda tam anlamıyla gelişimlerini tamamlamadığı için erişkinlere göre test sonuçları daha zayıf olarak ortaya çıkar ve subgruplarının tespiti mümkün olmaz. Erişkin insan serumunda kişinin kendi eritrositlerinde bulunmayan A/B antijene karşı gelişmiş antikor mevcuttur. Her iki antikorda doğumu takiben 4-6 ay sonra ortaya çıkar. Sonuç olarak, yenidoğanlarda ters gruplama yapılamaz. Yenidoğan kan gruplandırmasının teyidi A/B antijenlerinin tam olarak oluşumlarını tamamlamasının takiben 2-4 yıl sonra yapılmalıdır.

D antijeni aynı zamanda zayıf D antijeni doğumda gelişini tamamlamıştır. Yenidoğanda Rh (D) ve zayıf D tayini eğer anne Rh (D) negatif ise, mutlaka yapılmalıdır. Yenidoğan eritositlerinin in-utero antikorlarla kaplı olmasının önemi anlaşıldığından beri, yenidoğan kan grup örneklerinde direk Coombs testi aşağıdaki şekillerde yapılabilir;

"ABO/Rh Yenidoğan Kartı" insan kaynaklı antisera ve Diluent 1 içinde eritrosit süspansiyonu kullanılarak, oda ısısında 10dk. bekletilerek yapılabilir. Bu yolla zayıf D tayini de yapılabilmektedir.

"DiaClon ABO/Rh Yenidoğan Kartı" monoklonal antisera ve Diluent 2 içinde eritrosit süspansiyonu kullanılarak hiç beklemeden yapılabilir (kullanılan anti-D tüm zayıf D antijenleri ile reaksiyon vermez).

Yöntem: ID ile Yenidoğanda Eşzamanlı ABO/Rh Kan Grup Tayini ve Direkt Coombs Testi

"ABO/Rh Yenidoğan" ID kartı, jel içinde süspanse halde insan kaynaklı anti-a, anti-B içermektedir. Kullanılan anti-D insan lgG karışımıdır. Ctl tüpü nagatif kontrol içindir.
Anti-humanglobulin serumu tavşan anti-lgG ve monoklonal anti-C3d (Klon no C 139-9) karışımdır.

Numune:
Kordon veya topuktan alınan numune kan kullanılabilir. Normalde uygulama öncesi hücreleri yıkamak gerekmez (E bölümüne bakınız). Kordondan alınan kan numunesinde Wharton jeli bulaşığı olmasına dikkat edilmelidir. Numuneler sitratlı, EDTA, CPD-A veya heparinli tüplere alınmalıdır. Doğru sonuç almak için taze numune kullanılması tercih edilmelidir.

Kan Numunesinin Hazırlanması:
Aşağıda belirtildiği gibi dilüent 2 içinde %0.8'lik eritrosit süspansiyonu hazırlanmalıdır; Kulanmadan önce dilüenti oda ısısına getiriniz.
Temiz bir tüp içine 1 ml ID-Dilüent 2 koyunuz; 10 µl kan ekleyiniz ve yavaşça karıştırınız. Hücre süspansiyonu hemen kullanılmalıdır.

Testin Uygulanması.
Kurumuş, hava kabarcığı olan veya tahrip olmuş ID kartlarını kullanmayınız.

  1. Hastanını adı/soyadını ve numarasını kart üzerine yazınız, alüminyum şeridi açınız.
  2. ID-Karttaki 6 mikrotüpede 50 µl eritrosit süspansiyonu koyunuz.
  3. İlk 5 mikrotüpe 25 µl Dilüent 1 koyunuz
  4. Oda ısısında 10 dakika bekletiniz.
  5. ID-santrifüjünde ID-kartları 10 dakika santrifüj ediniz.
  6. Sonucu değerlendiriniz.

Sonuçların Değerlendirilmesi:

  1. Prensipler
    Pozitif: Jelin üzerinde çizgi oluşturacak veya jelin içinde yayılmış şekilde aglütine hücrelerin varlığı pozitif olarak değerlendirilir.
    Negatif: Mikrotüplerin dibinde hücrelerin yoğun olarak çökmesi negatif olarak değerlendirilir.
  2. ABO kan grupları için reaksiyon şekilleri:
      Anti-A Anti-B Anti-AB
    A + den ++++ - + den ++++
    B - + den ++++ + den ++++
    AB + den ++++ + den ++++ + den ++++
    O - - -

    Dikkat: Kontrol tüpü mutlaka negatif olmalıdır. Eğer kontrol tüpü potizif ise ABO sonucu geçerli değildir. E başlığında anlatıldığı şekilde testi tekrar ediniz.
  3. Rh (D) Kan Grubu İçin Reaksiyon Şekilleri.
    Rh(D) pozitif ++++
    Rh(D) zayıf pozitif +den+++
    Rh(D) negatif -
    Dikkat: Ctl tüpü mutlaka negatif olmalıdır. Eğer ctl tüpü pozitif ise Rh(D) sonucu geçerli değildir. E başlığında anlatıldığı şekilde testi tekrar ediniz.
  4. Direkt Coombs Testi İçin Reaksiyon Şekilleri:
    Negatif sonuç, tespit edilebilen antikorların yenidoğan eritrosit membranlarında bulunmadığı anlamına gelmektedir. Pozitif sonuç (+den++++) yenidoğan eritrositlerinin duyarlı olduğu anlamına gelmektedir (eritrositler antikorlarla kaplıdır).
  5. Notlar:
    1. Ctl tüpünün pozitif olduğu durumlarda aşağıdaki önerileri uygulayınız;
      Dilüent 2 ile %0.8'lik eritrosit süsyansiyonu hazırlamadan önce %0.9'luk izotonik serum solüsyonu ile eritrositlere sıcak yıkamak uygulayınız. Bundan sonra kan numunesini hazırlayarak testi uygulayınız. Eğer ctl pozitifliği kaybolursa B,C,D başlığı altında belirtilen uygulamalara devam edilir.
    2. Ctl pozitifliği bu uygulamaya rağmen devam ederse, güvenilir ABO, Rh tespiti mümkün değildir. Bu durumda "DiaClon ABO/Rh Yenidoğan Kartı" veya "DiaClon ABO/Rh" kartlarını uygulama prensiplerine uygun olarak kullanınız.

Sınırlamalar:

  • Bakteriyel veya diğer kontaminasyonlar yalancı pozitif/negatif sonuçlara sebep olabilir.
  • Fibrin artıkları aglütine olmamış eritrositleri engelleyerek santrifüjü takiben jelin üst kısmında pembe bir çizgi oluştururlar ancak bu durumda eritrositlerin çoğu tüpün dibine çökmüştür.
  • Uygulama ile ilgili kurallara ve cihazlara sadık kalınarak çalışılmalıdır.
  • Eritrosit süspansiyonu için önerilenin dışında solüsyon kullanılması sonuçları farklılaştırır.
  • Fazla yoğun eritrosit süspansiyonları yalancı pozitifiliğe neden olabilir.

ID ile Fetomaternal Hemoraji (FMH) Tarama Testi

ID-FMH tarama testinde özel olarak hazırlanmış bir anti-D antikoru kullanılmaktadır. Bu antikor anne kanında dolaşan ve serbest D-antijen bölgeleri taşıyan fetüse ait Rh D-pozitif hücreleri tanımaktadır. İşlem, Rh D-pozitif endikatör test eritrositler kullanılarak antikor tüketimi esasına dayanır. Sonuçlar standardize edilmiş hücre karışımlarının sonuçlarıyla kıyaslanarak feto-maternal kanamanın boyutu hesaplanır. Diğer yöntemlerin özelleşmiş laboratuarlar (örneğin flow cytometry) gerektirmesine karşın ID-FMH testi rutin kan bankalarında bile kolayca uygulanabilir bir yöntemdir.

Test ile Rh D-negatif anne kanındaki % 0.1 oranındaki fetal Rh D-pozitif kan saptanabilmektedir.

F. DİĞER KAN GRUP SİSTEMLERİNDE JEL TEKNOLOJİSİ

Yöntem: ID ile P1, Lea, Leb, Lua, Lub, k, Kpa, Kpb, Jka, Jkb, M, N, S, s, Fya, Fyb Antijenlerinin Saptanması

ID-kartları:

  1. Her antijen için özel kartlar kullanılabilir.
  2. Profil kartları
ID-Profil-1: P1, Lea, Leb, Lua, Lub (antikorlar kuyucukta hazır)
ID-Profil-2: k, Kpa, Kpb, Jka, Jk (antikorlar kuyucukta hazır)
ID-Profil-3: M-N-S-s-Fya-Fyb (antikorlar çalışma sırasında kuyucuklara eklenecek)

TESTİN YAPILIŞI:
ERİTROSİT SÜSPANSİYONU
ID-Diluent 2 . . . . . . . . 1ml
Konsantre eritrosit. . . . . 10 µl
İyice karıştırılır.

TEST:

  1. Kullanılacak karta hastanın, adı protokol numarası yazılır.
  2. Mikrotüplere 50 µl eritrosit süspansiyonu dağıtılır.
  3. Her mikrotüpe uygun ID-antiserum 50 µl (veya flakonun damlalığı ile bir damla) eklenir.
  4. 37C'da 15 dakika inkübe edilir.
  5. Kart santrifuj edilir ve değerlendirilir.

DEĞERLENDİRME:
Aglutinasyon ++++,+++,++,+,- olarak kart üzerinde tanımlanır.

G. KALİTE KONTROL VE ID

Kan bankalarında kullanılan materyaller, ekipman ve elemanların performansı sonuçları etkileyebilir. Kan bankalarının periyodik olarak internal kalite kontrol çalışmaları yapması kan gruplarını ve antikorları saptamadaki başarılarını göstermesi, problemlerin erken farkedilmesini sağlaması yönünden önemlidir.

Yöntem: İç Kalite Kontrol

KAN GRUPLARI: 4 veya 6 farklı test hücresi vardır. Bu hücrelerin jet testte çeşitli antiserumlarla oluşturdukları aglutinasyon şiddeti formda belirtilmiştir (ABO, rh, Kell sistemi).

  1. ABO sistemi: A1, A2. B,O
  2. Rh subgrup: D, Du dd, C, c, E, e, Cw+, Cw-
  3. Kell: K+,K-

ANTİKOR SAPTAMA: Anti-c, Anti-Fya pozitif test serumları kullanılır. Bu serumların Coombs, enzim testlerindeki aglutinasyon şiddetleri formda belirtilmiştir.

TESTİN YAPILIŞI:

Kan Gruplarının Saptanması:
HÜCRE SÜSPANSİYONU:

  1. Test hücreleri karışması sağlanır. 200µl bir santrifj tüpüne aktarılır. Santrifuj edildikten sonra supernatan atılır.
  2. Sedimentin üzerine 200µl ID-Diluent 1 eklenir ve iyice karıştırılır. 10 dakika oda ısısında bekletilir.

TEST:

  1. Her test hücresi için bir ABO/Rh ve birde Rhsubgrup + Kell kartı hazırlanır.
  2. Mikrotüplere 10µl hücre süspansiyonu eklenir.
  3. Sentrifuj edilerek değerlendirilir. Aglutinasyon şiddetleri formda belirtilen değerler ile kıyaslanır.

Antikor Saptama: İki ayrı yaklaşım şekli denenebilir.

  1. ID-Diacell I+II+III P veya ID-Diapanel P'den "c+" test hücrelerinden birisi seçilir ve Anti-c test serumu ile enzim test çalışır sonuç formdaki aglutinasyon şiddeti ile karşılaştırılır.
  2. ID-Diacell I+II+III veya ID-Diapanel'den "Fya+" test hücrelerinden biri seçilir ve Anti-Fya test serumu ile coombs test çalışır sonuç formdaki aglutinasyon şiddeti ile karışılaştırılır.
ID-Diacell I+II+III ve ID-Diacell I+II+III P test hücreleri kullanılarak Anti-c ve Anti-Fya test serumları ile Coombs ve enzim tet ile antikor tarama testi yapılır.

G. PAROKSİSMAL NOKTÜRNAL HEMOGLOBİNÜRİ (PNH) VE JEL TEKNOLOJİSİ

PNH (Marchiafava-Micheli Sendromu) duyarlı eritrositlerin aralıklı olarak kompleman kaynıklı intravasküler hemoliziyle karakterize bir klinik durumdur. Bu durumun sebebi DAF (decay accelerating factor CD 55), C8BP (C8 bağlayıcı protein), MIRL (reaktif lizis membran inhibitörü) gibi proteinlerin eksikliğidir. PNH'nin teşhisi asit hemolizis ve sukroz lizis testleriyle konulur. Anti-DAF ve anti-MIRL gibi monoklonal antikorlar kullanılarak yapılan jel testiyle anormal eritrositler kolaylıkla ve çok basit olarak tespit edilebilir.

Yöntem: ID ile PNH Tarama Testi

Reajenler:

  • ID-Kart "PNH testi" jel içinde süspanse edilmiş fare antijenlerine karşı gelişmiş tavşan antikorları içeren 6 tüpten oluşmaktadır.
    Oda ısısında (18-25 C) saklanmalıdır.
  • ID-PNH test reajenleri: anti-DAF (monoklonal, klon no BRIC 216) ve anti-MIRL (monoklonal, klonal no NEM 43), kullanıma hazır 1,4 ml şişelerde.
  • ID-PNH kontrol (negatif kontrol, anti-DAF ve anti-MIRL için dilüsyon bafırı) kullanıma hazır 1,4 ml şişelerde.
2-8 C'de saklayınız.
Son kullanma tarihi etiketdedir.

Örnek Materyal
Örnek almadan önce hastada özel bir uygulamaya gerek yoktur. Kabul edilen flebotomi yöntemlerine göre kan örneği alınır. Tercihen kan örneği sitratlı EDTA, heparin veya CPD-A'li tüplere alınmalıdır. Güvenilir sonuç alınabilmesi için yeni alınmış kan örneği kullanılmalıdır.
Kan Örneğinin Hazırlanması:
Aşağıda belirtildiği şekilde ID-Diluent 2 ile %0.8'lik eritrosit süspansiyonu hazırlayınız.

  • Temiz bir tüp içine 1 ml ID-Diluent 2 damlatınız.
  • 10ìl kan ekleyiniz ve hafifçe karıştırınız.
  • Hücre süspansiyonu hazırlanır hazırlanmaz kullanılmalıdır.

Test Uyglaması
Kurumuş, hava karacığı içeren ve tahrip olmuş kartları kullanmayınız.
Her hasta için mutlaka negatif kontrol kullanınız.
  1. PNH ID-Kartının 3 mikrotüpünün üzerine hastanın adı ve soyadını yazınız, tüpleri kapayan alüminyumu açınız.
  2. PNH ID-Kartındaki ilk 3 mikrotübe (MIRL,DAF,ctl) 50 µl hücre süspansiyonu koyunuz.
  3. 50 ìl anti-MIRL, anti-DAF, PNH-ctl (negatif kontrol) yukarıda bahsedilen mikrotüplere ekleyiniz.
  4. ID-Inkübatöründe 37 C'de 15 dakika inkübe ediniz.
  5. ID-Santrifüjünde ID-Kartları 10 dakika santrifüj ediniz.
  6. Sonuçları okuyunuz.
Sonuçların Yorumlanması
  1. Prensip
    Pozitif: Hücrelerin jel yüzeyindeki kırmızı çizgi oluştuğu durumlar
    Negatif: Hücrelerin mikrotüplerin dibine çöktüğü durumlar
  2. PNH reaksiyonları
    DAF ve MIRL antijenlerinin varlığında +++/++++ sonuçlarının alınması durumunda eritrositlerin normal olduğu düşünülür. Bu durum PNH açısından sonucun negatif olduğunu gösterir. Ctl tübü mutlaka negatif olmalıdır.
    Eritrositlerin yoğun olarak lgG ile kaplı olduğu durumlarda ctl tübünde pozitif sonuç görülebilir, bu durumda otoantikor ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra test tekrarlanmalıdır.
    Negatif reaksiyonlar DAF ve MIRL antijenlerinin olmadığını gösterir ve PNH açısından sonucun pozitip oldoğunu gösterir. Çift populasyon görülmesi hücrelerin bir kısmının DAF ve MIRL antijenlerini atladığını gösterir ve PNH açısından zayıf pozitif olarak değerlendirilir.
Not: DAF ve MIRL'ye karşı negatif sonuç alınan durumlarda PNH akla gelmelidir.

Notlar:

  • PNH'nin derecesine göre DAF ve MIRL antijenlerini atlayan hücre miktarı farklıdır.
  • Çift populasyon PNH'nin varlığına gösterir. Çift populasyonun açıklanması için hücrelerin minör populasyonu %5'lik olmalıdır.
  • Etkilenmiş hücre miktarının bilinmesinin zorunlu olduğu durumlarda ID-PNH testini takiben flow sitometre gibi kantitatif metodlar kullanılmalıdır.

I. HPA1a TİPLENDİRMESİ TESTİ

Bu test, DiaMed tarafından HPA 1a negatif fenotipli donörlerden elde edilen trombositlerin incelenmesi ve NAITP (Neonatal Alloimmun Trombositopeni) riskinin tanımlanması amacıyla geliştirilmiştir.

DiaMed HPA 1a antijen testi kullanıma hazır reajenleri, kolay test prosedürü, yüksek maliyetli laboratuvar ekipmanı gerektirmemesi ve 45 dakika gibi kısa bir sürede sonuç vermesi nedeniyle rutin uygulamalar için ideal bir testtir.

NAITP (Neonatal Alloimmun Trombositopeni) yaklaşık her 1000 canlı doğumda bir sıklıkta görülen bir hastalıktır ve yenidoğanı olduğu kadar fetusu da etkileyebilir. Neonatal Alloimmun Trombositopeni ile birlikte en sık görülen antijen olan Human Platelet Alloantijen 1a (HPA 1a)incelenen vakaların %83'ünde rapor edilmiştir. Pasif Edinsel maternal anti HPA 1a, fetusta kanama eğiliminin artmasının önde gelen nedenlerinden olan fetal/neonatal trombositlerin temizlenmesini tetikler. Bunlar yenidoğanda büyük oranda kafa içi kanamalar şeklinde olur ki bu kanamalar yenidoğan beyninde kalıcı mental bozukluklara neden olan düzeltilmeyen hasarlar oluştururlar.